一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，本方法包括以下步骤：采用ＭｅｇｒｅｓＣ１８柱２５０ｍｍ×４．６ｍｍｉ．ｄ．，５μｍ色谱柱；１０％（ｖ／ｖ）乙腈作为色谱流动相；流速为１．２ｍｌ／ｍｉｎ；荧光检测波长：０－５ｍｉｎ激发光波长２２８ｎｍ，发射光波长为３０６ｎｍ；５ｍｉｎ后激发光波长２８５ｎｍ，发射光波长为３５３ｎｍ；进样量：２０μｌ；室温下测定。本发明专利技术方法简单快速、准确、灵敏度高、可行性高，能满足临床血清样本的检测要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析化学领域，涉及一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法。
技术介绍
目前国内外报道的检测Tyr和Trp的方法较多，包括高效液相色谱法(HPLC)、高效 毛细管电泳法(HPCE)、质谱法(MS)等。HPCE分析时间较短，分离能力较强，但检测限(紫 外吸收检测器)不及HPLC，且重复性较差；质谱技术亦有操作复杂、重复性较差的不足之 处；相对来说，HPLC应用较广泛。色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)具有吲哚结构，自身能产 生荧光，故可采用荧光法检测。国内外已有采用HPLC-荧光法(HPLC-FD)或HPLC-紫外法 (HPLC-UV)分别单独检测血清中Tyr和Trp的报道，有采用HPLC-UV同时测定Tyr和Trp 的报道，也有采用高效液相色谱法测定脑脊液中Tyr和Trp含量的报道，但目前尚未有采用 HPLC-FD同时测定血清中的Tyr和Trp的报道。近来，Sanchez-Machado等用HPLC-FD同时 测定虾废料中的Tyr和Trp含量，但是线性范围窄，虽能满足虾废料中氨基酸的检测需要， 但不能满足临床血清样本的检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高效液相色谱_荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸 的方法，本专利技术分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测 要求。 本专利技术可以通过以下技术方案实现。 本专利技术采用的检测仪器是510色谱泵、2475型荧光检测器(Waters公司)、 HS2000色谱数据工作站(杭州英谱科技开发有限公司)、Rheodyne 7725手动进样器(带 20iiL进样环)。0. 22 ii m滤膜及其抽滤器(Millipore公司);Milli-Q纯水器(Millipore 公司)；TGLL 218台式高速冷冻离心机(湖南湘仪离心机厂)；SB2200型超声去气仪(上海 必信能有限公司)。 本专利技术的主要试剂有Tyr、 Trp、5_羟色胺(5_HT)、犬尿喹啉酸(Kyna)、苯丙氨酸 (Phe)、犬尿氨酸(Kyn)和肌酐(Cr)均购自Sigma公司；乙腈、甲醇均为色谱纯，购自美国 Tedia公司；醋酸锌、冰醋酸等均为国产分析纯，高氯酸为国产优级纯。 本专利技术采用的检测条件是其中色谱柱Megres C18柱(250mmX4. 6mm i. d.， 5ym，江苏汉邦科技有限公司);流动相10% (v/v)乙腈；流速1.2mL/min;荧光检测波 长0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm ;5min后激发光波长285nm，发射光波长 为353nm ;进样量20 y 1 ;室温下测定。 本专利技术的检测原理色氨酸和酪氨酸可以产生自然荧光，利用荧光检测器可调波 长的性质选择色氨酸和酪酸的最佳检测波长，在最佳色谱条件下使色氨酸和酪氨酸分离，色谱分离后的两种氨基酸经过荧光检测器和色谱数据工作站的检测和处理，作出色谱图，然后根据色谱图完成氨基酸的含量分析和测定。本专利技术包括以下步骤a、采用Megres C18柱250mmX4. 6mm i.d. ，5um色谱柱； b、流动相的组成:10% (V/V)乙腈; c、流速为1. 2ml/min，进样量20iU，室温下测定; d、利用荧光检测器扫描确定色氨酸和酪氨酸的最大激发光波长和发射光波长，进而使得两种物质均在其最佳波长下得到检测。可调波长设定为0-5min激发光波长228nm，发射光波长为306nm ;5min后激发光波长285nm，发射光波长为353nm ; e、对建立方法进行方法学评价混合标准品和血清样品的检测、标准曲线和检测限、精密度的评价、回收率的考察和干扰试验。 与现有技术相比，本专利技术具有的优点和效果如下 1、本专利技术首次成功建立了一种HPLC-FD同时测定人血清中Tyr和Trp的方法。Tyr 和Trp具有自然荧光，本专利技术利用荧光检测器自动转换激发光与发射光波长的优势，选择 Trp和Tyr的最佳波长，使Trp和Tyr的色谱峰峰面积最大，检测灵敏度增加；与已报道方 法比较，本专利技术分析时间短，试剂消耗少，灵敏度高，特异性好，能满足临床血清样本的检测 要求。 2、本专利技术原理简单、操作简便、快速(9min可完成检测)、可行性高。 3、本专利技术灵敏度高、特异性好、能满足血清标本酪氨酸和色氨酸含量测定要求， 适合于临床和科研应用。方法学评价显示，在一定范围内，两种物质的标准曲线的线性关 系良好(rX).990)，线性范围宽；在该方法下两种物质的检测限低。色氨酸为回收率为 88. 8 % -97. 2 % ，酪氨酸回收率为90. 5 % -108. 8 % ，色氨酸和酪氨酸的日内和日间精密度 均小于5%，苯丙氨酸(Phe)、犬尿氨酸(Kyn)、犬尿喹啉酸(Kyna) 、5_羟色胺(5-HT)和肌酐 (Cr)对测定无干扰。附图说明图1为混合标准品的色谱图； 峰序号Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸； 图2为本专利技术测定的血清样本的色谱图； 峰序号Trp-色氨酸，Tyr-酪氨酸。具体实施例方式以下实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。 实施例l，试剂的配制和血清样本的收集处理 1.标准溶液的配制 准确称取TrplO. Omg、 TyrlO. Omg用2. 5% (v/v)的高氯酸溶液溶解并稀释至 10. OmL，混匀，分别制成4900 y mol/LTrp标准储备液和5500 y mol/LTyr标准储备液，分装 后置于-3(TC冰箱中备用。使用前分别取2种标准储备液加2. 5%的高氯酸配成标准工作 液(含Trp 24. 5 u mol/L， Tyr 55 u mol/L)。 2.蛋白质沉淀剂 用超纯水配制5% (v/v)的高氯酸溶液作血清蛋白质沉淀剂。 3.流动相的配制 用超纯水配制10% (v/v)的乙腈溶液，再用0. 22 m微孔滤膜过滤，使用前超声脱 气20min。 4.干扰试验用样本溶液 用2. 5 % (v/v)的高氯酸溶液分别配制 一 定浓度Phe (610 y mol/L)、 5-HT(114iimol/L)、 Kyn(1.96iimol/L)、 Kyna(26. 17nmol/L)禾PCr(88. 14 ii mol/L)的标准 液。 5.血清样本的收集处理 将受试者空腹静脉血2mL置于洁净促凝管内，3000g离心分离血清，取100 y 1血清 于Eppendorf管内，加入等体积5% (v/v)高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀，室温 下放置10min以充分沉淀血清中的蛋白质，10000g离心10min(4°C )后将上清液转入另一 Enpendorf管内，相同条件下再离心lOmin，取上清液20y L进样分析。 实施例2 ，色谱条件的优化 1.检测波长的选择 用流动相稀释一定浓度的Tyr和Trp标准溶液，以流动相空白调零，在2475型荧 光检测器上，通过对Tyr和Trp的激发光谱和发射光谱扫描，分别得到最大激发光波长 入exTyr = 228nm、入exTrp = 285nm ;最大发身寸光波长入emTyr = 306nm、入emTrp = 353nm。 2.流动相中有机物的比例对保留时间的影响 配制不同乙腈含量(5%、8%、10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效液相色谱－荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：ａ、采用ＭｅｇｒｅｓＣ１８柱２５０ｍｍ×４．６ｍｍｉ．ｄ．，５μｍ色谱柱；ｂ、流动相：１０％（ｖ／ｖ）乙腈；ｃ、流速为１．２ｍｌ／ｍｉｎ，进样量：２０μｌ，室温下测定；ｄ、荧光检测波长设定为：０－５ｍｉｎ激发光波长２２８ｎｍ，发射光波长为３０６ｎｍ，５ｍｉｎ后激发光波长２８５ｎｍ，发射光波长为３５３ｎｍ。

【技术特征摘要】
一种高效液相色谱-荧光法同时测定血清色氨酸和酪氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤a、采用Megres C18柱250mm×4.6mm i.d.，5μm色谱柱；b、流动相10％(v/v)乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐爱国，任亚萍，项忠元，周前选，
申请(专利权)人：中南大学湘雅二医院，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]