一种慢病毒表达载体的设计及应用制造技术

本发明专利技术属于分子生物学及细胞生物学领域，具体涉及一种慢病毒表达载体的设计及应用。本发明专利技术设计载体，采用CMV enhancer和CMV promoter作为插入基因的转录起始元件；采用EF1a‑core promoter作为筛选标记嘌呤霉素和绿色荧光蛋白GFP的转录起始元件，嘌呤霉素抗性基因和GFP序列之间通过T2A连接串联表达；采用慢病毒载体作为该载体骨架，将上述两个元件插入骨架载体，合理设计优化而成。采用本发明专利技术设计的慢病毒载体，可以高效表达插入基因，表达效率优于目前同类型特征的载体。

Design and application of a lentivirus expression vector

【技术实现步骤摘要】
一种慢病毒表达载体的设计及应用
本专利技术属于分子生物学及细胞生物学领域，具体涉及一种慢病毒表达载体的设计及应用。
技术介绍
慢病毒载体(Lentiviralvector)是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效的将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体介导的基因表达持续且稳定，原因是插入基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒有广泛的宿主，可感染分裂和不分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，特别适合质粒载体转染效率低的细胞。目前，有多种形式的慢病毒表达载体，都是以慢病毒载体骨架，加载不同的基因操控元件设计而成。进行基因过表达时，可通过不同的实验目的选择不同元件组成的慢病毒表达载体。美国SystemBiosciences公司开发的具有双启动子的pCDH系列慢病毒载体，载体大小不超过9000bp，允许插入较大片段的基因，具有抗生素抗性基因和荧光蛋白双重筛选基因，可通过抗生素筛选获得稳转细胞株和通过荧光蛋白检测转染效率，这些独特优势特性使其成为主流的慢病毒表达载体之一。然而，专利技术人在实验中发现，pCDH系列载体的插入基因的表达水平并不很高，不能满足一些实验要求。而市场上同类型慢病毒表达载体，又不具备pCDH载体的优势特性。因此，很有必要设计一种兼具载体小、双重筛选标记、高水平表达插入基因等三个特征的慢病毒表达载体。
技术实现思路
针对上述问题本专利技术提供了一种慢病毒表达载体的设计及应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：一种慢病毒表达载体，慢病毒表达载体的核苷酸序列为SEQIDNO.1。进一步，所述载体的图谱为图1，序列见SEQIDNO.1。进一步，所述序列，含有以下载体元件：a.Ampicillin抗性基因：允许载体在E.coli中使用Ampicillin筛选的序列；b.PUCOri：允许载体在E.coli中高拷贝复制的序列；c.RSVpromoter：促进病毒RNA在包装细胞中的转录的序列；d.5'LTR-DeltaU3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；e.3'LTR-DeltaU3：病毒基因组整合进入宿主基因组的整合位点序列；病毒RNA在包装细胞中的转录终止序列；f.Ψ:病毒RNA包装为病毒的信号序列；g.RRE：HIV-1的Rev蛋白响应元件序列，允许病毒RNA通过Rev蛋白途径出核；h.CPPT：HIV-1富含嘌呤的片段序列，促进病毒感染宿主细胞过程中病毒RNA转入宿主细胞核；i.CMVenhancer/promoter：促进目的基因的高效表达的增强子和启动子序列；j.BamHI/SalI/XhoI/XbaI：酶切位点序列，便于外源基因插入；k.EF-1acorepromoter：促进筛选基因的表达的启动子序列；m.EGFP:T2A:Puro:筛选基因嘌呤霉素和GFP的表达序列；l.WPRE：病毒转录后修饰元件序列，增强病毒RNA在包装细胞中的稳定性；一种慢病毒载体的应用，所述载体用于插入基因的高效表达；n.SV40earlypA：进一步增强病毒RNA在包装细胞中的转录终止序列。一种慢病毒表达载体的应用，基于其核苷酸序列，可应用于下述五个方面：可插入目的基因、可包装为慢病毒感染目的细胞、可高水平表达插入目的基因、可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株、可通过GFP检测转染效率。一种慢病毒表达载体的应用方法：(1)插入目的基因：通过PCR技术获得插入目的基因的片段，采用酶切连接的方法将目的基因片段插入慢病毒表达载体的多克隆位点；(2)包装为慢病毒感染目的细胞：慢病毒表达载体在293T细胞中转录生成病毒基因组RNA，包装载体在293T细胞中转录翻译生成病毒蛋白，然后病毒基因组RNA与病毒蛋白在细胞中组装成慢病毒，慢病毒从293T细胞中释放到培养基中，收集慢病毒，将慢病毒与目的细胞共孵育，感染目的细胞；(3)通过嘌呤霉素筛选步骤(2)中慢病毒感染后的细胞获得稳转细胞株：慢病毒感染目的细胞48h后，加入嘌呤霉素至2-10μg/mL，培养3代以上，直至细胞不再死亡，获得稳定细胞株，收集稳定细胞株，通过westernblot检测插入目的基因的表达量；(4)高水平表达插入目的基因：通过westernblot检测，慢病毒感染48h后的目的细胞或稳转细胞中，目的基因的表达，判定是否高水平表达；(5)通过GFP检测转染效率：该慢病毒转染293T细胞后，或者包装好的慢病毒感染目的细胞后，都可以通过荧光显微镜观察GFP的强度判定转染效率。进一步，所述酶切连接中酶切位点为BamHI、SalI、XhoI、XbaI。进一步，所述包装载体可选用psPAX2和PMD2.G，也可选用REV、VSV-G和PMDL。进一步，所设计载体应用于目的基因在哺乳动物细胞中的高效表达。与现有技术相比本专利技术具有以下优点：本专利技术设计了一种慢病毒表达载体，命名为pRSV-CMV-Flag-EF1-Puro-T2A-GFP，具有嘌呤霉素抗性基因和GFP双重筛选基因，可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株和通过GFP检测转染效率，与具有同类特征的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro相比，可高效表达插入基因。1.本专利技术设计的载体，采用CMVenhancer和CMVpromoter作为插入基因的转录起始元件，能够高水平表达插入基因。2.本专利技术设计的载体，采用嘌呤霉素抗性基因和GFP作为筛选基因，有利于获得稳定细胞株，能够利用GFP随时监测转染效率。3.本专利技术设计的载体，载体长度小，插入片段较大的基因后，对重组质粒转染效率和病毒包装效率的影响小，有利于分子量较大蛋白的过表达。4.本专利技术设计的载体，在兼具益处1、2、3的基础上，通过慢病毒转染的方式实现插入基因的高效表达。附图说明图1为pRSV-CMV-Flag-EF1-Puro-T2A-GFP载体结构图谱；图2为分别采用慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)和pRSV-CMV-Flag-EF1-Puro-T2A-GFP(pRSV)在HCT116细胞中过表达插入基因Insert的westernblot检测图；图3为图2中westernblot检测条带的相对定量分析图，(A)为过表达插入基因细胞中的过表达的Insert相对于空载细胞中的倍数；(B)为过表达插入基因细胞中的总Insert相对于空载细胞中的倍数。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种慢病毒表达载体，其特征在于：慢病毒表达载体的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。/n

【技术特征摘要】
1.一种慢病毒表达载体，其特征在于：慢病毒表达载体的核苷酸序列为SEQIDNO.1。


2.一种慢病毒表达载体的应用，其特征在于：基于其核苷酸序列，可应用于下述五个方面：可插入目的基因、可包装为慢病毒感染目的细胞、可高水平表达插入目的基因、可通过嘌呤霉素筛选获得稳转细胞株、可通过GFP检测转染效率。


3.一种慢病毒表达载体的应用方法，其特征在于：
(1)插入目的基因：通过PCR技术获得插入目的基因的片段，采用酶切连接的方法将目的基因片段插入慢病毒表达载体的多克隆位点；
(2)包装为慢病毒感染目的细胞：
慢病毒表达载体在293T细胞中转录生成病毒基因组RNA，包装载体在293T细胞中转录翻译生成病毒蛋白，然后病毒基因组RNA与病毒蛋白在细胞中组装成慢病毒，慢病毒从293T细胞中释放到培养基中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：武兴康，鲁玉凡，韩晨晨，秦雪梅，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14