淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用制造技术

本发明专利技术涉及淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用，属于生物制药领域。本发明专利技术提供的淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维。本发明专利技术还提供所述的淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。本发明专利技术所述的淀粉样六肽可通过聚合成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，发挥广谱抑制细菌、真菌生物膜形成的作用，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，但淀粉样六肽不杀菌，对细胞毒性小或无毒性，不会造成细菌耐药，有望成为新型的高效抗生物膜形成的廉价药物。

Amyloid hexapeptide and its application in broad-spectrum inhibition of bacterial and fungal biofilm

【技术实现步骤摘要】
淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用
本专利技术涉及淀粉样六肽及其广谱抑制细菌和真菌生物膜的应用，属于生物制药领域。
技术介绍
人类约60％细菌性疾病是由生物膜引起的，细菌形成生物膜后极大的增强了对外界环境的抵抗能力。目前临床上可用于控制生物膜的药物均为杀菌剂，包括洗必泰、抗生素等，长期使用杀菌剂可造成体内菌群失调，使细菌产生耐药，导致全身疾病。而目前尚无任何有效的单纯抗生物膜而不杀菌的药物，因此，有待寻找新型的抗生物膜而不杀菌的药物。多肽类具有合成简单、毒性小、药效快及免疫原性低等特点，近年受到越来越广泛的关注。但目前研究的肽抑制剂，包括抗菌肽等，多具有杀菌作用，通过减少细菌数量来减少细菌生物膜的形成，存在效率低、不能杀死生物膜内部的“休眠菌”、可能导致细菌耐药等缺陷。因此，目前的抗菌肽并非理想的抗生物膜制剂。2012年Chu等在《Science》上首次报道，人小肠潘氏细胞分泌的防御肽6(32个氨基酸组成)，通过形成淀粉样纤维包裹细菌，抑制其生物膜形成，且防御肽6无杀菌作用。随后，2016年Kumar等发现淀粉样多肽Aβ单体(42个氨基酸组成)可结合到细菌膜上，逐渐聚合成淀粉样纤维包裹细菌，起到阻止细菌侵袭的作用。可见，淀粉样多肽可能成为新型的抗生物膜而不杀菌的制剂。但以上两种多肽长度较长，体外合成较困难，花费成本高，且淀粉样多肽Aβ属于阿尔兹海默症的致病蛋白，不适宜临床应用。如肽段越短，则合成越简单，越节约成本。因此，有必要寻找高效、价廉、毒性小的新型淀粉样肽制剂。研究表明，4-7个氨基酸组成的短肽是形成淀粉样纤维的最小结构。Bednarska等认为，从细菌蛋白质组中寻找淀粉样肽抑制剂，可能起到更强的效果。变异链球菌是公认的致龋菌，其表面含有淀粉样纤维结构，Pac蛋白的C123段(由487个氨基酸组成)是变异链球菌淀粉样纤维的组成蛋白。因此，为寻找更高效的抗生物膜而不杀菌的淀粉样多肽，我们从变异链球菌淀粉样组成蛋白-Pac蛋白C123段出发，寻找可抑制细菌生物膜形成的淀粉样短肽抑制剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种具有抑制细菌生物膜形成和不杀菌作用的淀粉样六肽。本专利技术的另一目的是提供所述淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种淀粉样六肽，所述淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维。优选地，所述淀粉样六肽的氨基酸序列包括Ala-Ser-Asn-Ile-Val-Ile、Thr-Ser-Phe-Val-Leu-Val、Gly-Ile-Asp-Leu-Lys-Ile、Phe-Ala-Lys-Val-Asp-Ile、Ile-Ala-Val-Gly-Thr-Phe，其对应的氨基酸缩写分别为现ASNIVI、TSFVLV、GIDLKI、FAKVDI、IAVGTF。本专利技术所述的淀粉样六肽的具体特征：六肽，可用ZipperDB、Tango和Waltz等淀粉样纤维预测软件预测具有形成淀粉样纤维能力；合成时通过N端乙酰化和C端酰胺化修饰；体外证实可形成刚性淀粉样纤维；可广谱抑制细菌、真菌生物膜的形成，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌；通过形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，阻止生物膜形成；不杀菌；对细胞毒性小或无毒性。另一方面，本专利技术还提供所述的淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。作为本专利技术所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽用于抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌生物膜的形成。所述淀粉样六肽具有广谱抗生物膜形成的作用，且不具有杀菌作用。作为本专利技术所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽用于形成淀粉样纤维包裹细菌和真菌。作为本专利技术所述应用的一种优选实施方式，所述革兰氏阳性菌包括变链菌、血链球菌和金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌包括大肠杆菌；真菌包括白色念珠菌。作为本专利技术所述应用的一种优选实施方式，所述淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌无杀菌作用。再一方面，本专利技术还提供一种抑制生物膜形成的药物，所述药物含有本专利技术所述的淀粉样六肽。作为本专利技术所述药物的一种优选实施方式，所述药物还含有药学上可接受的载体。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维，可通过形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌，起到广谱抑制细菌、真菌生物膜的形成，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌，但不杀菌，对细胞毒性小或无毒性，不会造成细菌耐药，有望成为新型的高效抗生物膜形成的廉价药物。附图说明图1为表1编号为P1-P13的六肽体外聚合，经TEM观察能否形成淀粉样纤维的结果示意图。图2为淀粉样六肽对生物膜形成和游离菌增殖的影响结果图。图3为淀粉样六肽形成淀粉样纤维包裹变链菌透射电镜和扫描电镜观察图。图4为淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的生物膜形成的抑制结果图。图5为淀粉样六肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌游离菌增殖的影响结果图。图6为六肽对人口腔粘膜上皮角化细胞(NormalOralKeratinocyte，NOK)形态及增殖的影响结果图。图7为其他物种来源的淀粉样六肽对变链菌生物膜形成的影响结果图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1本实施例为本专利技术所述的在体外可聚合成淀粉样纤维的淀粉样六肽5条ASNIVI、TSFVLV、GIDLKI、FAKVDI、IAVGTF。通过淀粉样纤维预测软件预测，用ZipperDB、Tango和Waltz三种淀粉样纤维预测软件预测C123序列中可形成淀粉样纤维的短肽段。筛选的淀粉样短肽需满足：至少有两个软件共同指向，且对应ZipperDB的结合能<-23kcal/mol。并在体外经透射电镜观察，证实其可聚合成淀粉样纤维。具体预测方法为：登陆Pubmed，检索protein，输入streptococcusmutans，Pac，下载氨基酸序列信息，筛选出C123段序列(1000-1486aa)。登陆ZipperDB(http://services.mbi.ucla.edu/zipperdb)，Tango(http://tango.crg.es)和Waltz(http://waltz.switchlab.org)网站，输入C123序列，得到预测的C123段可形成淀粉样纤维的序列。综合以上三种软件预测特点，选取Waltz或Tango可与ZipperDB交集的短肽，且ZipperDB显示RosettaEnergy<-23kcal/mol。预测筛选结果：根据筛选条件筛选出14条淀粉样短肽，且均为六肽，在体外成功合成13条，合成时通过N端乙酰化C端酰胺化保护六肽，模仿其在母体中状态，具体序列见表1。采用固相合成法合成上述六肽，具体方法如下：步骤1：选择400mg改性树脂开始合成多肽，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种淀粉样六肽，其特征在于，所述淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维。/n

【技术特征摘要】
1.一种淀粉样六肽，其特征在于，所述淀粉样六肽在体外可聚合成淀粉样纤维。


2.如权利要求1所述的淀粉样六肽，其特征在于，所述淀粉样六肽的氨基酸序列包括Ala-Ser-Asn-Ile-Val-Ile、Thr-Ser-Phe-Val-Leu-Val、Gly-Ile-Asp-Leu-Lys-Ile、Phe-Ala-Lys-Val-Asp-Ile、Ile-Ala-Val-Gly-Thr-Phe。


3.如权利要求1-2任一所述的淀粉样六肽在制备抑制生物膜形成的药物中的应用。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述淀粉样六肽用于形成淀粉样纤维包裹细菌或真菌。
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【专利技术属性】
技术研发人员：林焕彩，陈冬茹，
申请(专利权)人：中山大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：广东;44