自发性异肽键形成速率提高的蛋白质和肽标签及其用途制造技术

本发明专利技术涉及包含肽标签(肽)和多肽(蛋白质)的两部分接头，其能够自发形成异肽键，特别是其中：a)所述肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中：(i)在位置1处的X是精氨酸或无氨基酸；(ii)在位置2处的X是甘氨酸或无氨基酸；(iii)在位置5处的X是组氨酸或苏氨酸；(iv)在位置11处的X是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸；以及(v)在位置14处的X是精氨酸或赖氨酸，其中当在位置1处的X无氨基酸时，在位置2处的X无氨基酸；并且b)所述多肽包含：i)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；ii)包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列的(i)的一部分；iii)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸和以下中的一个或多个：1)在位置5处的苏氨酸；2)在位置16处的脯氨酸；3)在位置40处的精氨酸；4)在位置65处的组氨酸；5)在位置92处的脯氨酸；6)在位置100处的天冬氨酸；7)在位置108处的谷氨酸；8)在位置116处的苏氨酸，其中指定的氨基酸残基位于与SEQ ID NO：2中的位置等同的位置；或iv)包含与SEQ ID NO：101所示序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列的(iii)的一部分，其中所述氨基酸序列在位置10处包含赖氨酸，在位置56处包含谷氨酸和以下中的一个或多个：1)在位置16处的精氨酸；2)在位置41处的组氨酸；3)在位置68处的脯氨酸；和4)在位置76处的天冬氨酸，其中指定的氨基酸残基位于与SEQ ID NO：101中的位置等同的位置，并且其中所述肽和多肽能够在SEQ ID NO：1的位置10处的天冬氨酸残基和SEQ ID NO：2的位置34处或SEQ ID NO：101的位置10处的赖氨酸残基之间自发形成异肽键。

Protein and peptide tags with increased rate of spontaneous isopeptide bond formation and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】自发性异肽键形成速率提高的蛋白质和肽标签及其用途
本专利技术涉及两部分接头，其包含肽标签和多肽(蛋白质)，其能够自发形成异肽键。特别地，本专利技术的两部分接头可以看作是肽标签和多肽结合伴侣同源物对，当在允许肽标签与其多肽结合伴侣之间自发形成异肽键的条件下接触时，所述同源物对可以通过共价键缀合。还提供了编码所述两部分接头(即肽标签和多肽结合伴侣)的所述每部分的核酸分子、包含所述核酸分子的载体以及包含所述载体和核酸分子的宿主细胞。还提供了包含所述两部分接头(即肽标签和多肽结合伴侣)和/或核酸分子/载体的试剂盒。还提供了产生所述两部分接头(即肽标签和多肽结合伴侣)的方法以及本专利技术的两部分接头的用途。
技术介绍
细胞功能取决于大量可逆的非共价蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质在复合物中的精确排列会影响并决定其功能。因此，工程共价蛋白-蛋白相互作用的能力可以为基础研究、合成生物学和生物技术带来一系列新的机会。特别地，两种或更多种蛋白质的缀合以形成所谓的“融合蛋白”可以产生具有有用特性的分子。例如，将一种蛋白质聚集在一起通常会大大增强生物信号，例如疫苗上的重复抗原结构。具有不同活性的聚集蛋白也可以产生具有改善的活性的复合物，例如，通过酶的底物通道效应(substratechannelingbyenzymes)。通常，共价蛋白相互作用是通过二硫键介导的，但是二硫键是可逆的，不适用于还原性细胞区室，并且可以干扰蛋白折叠。肽标签是蛋白质分析和修饰的便捷工具，因为它们的小尺寸可最大程度地减少对蛋白质功能的干扰。肽标签易于遗传编码，其小尺寸可减少干扰其他相互作用的扰乱、生物合成的成本和免疫原性的引入。然而，肽标签与其肽或多肽结合伴侣之间的相互作用很少具有高亲和力，这限制了它们在稳定复合物形成中的效用。能够自发形成异肽键的蛋白质(所谓的“异肽蛋白”)已被有利地用于开发肽标签/多肽结合伴侣对(即两部分接头)，其彼此共价结合并提供不可逆的相互作用(参见例如WO2011/098772和WO2016/193746，都通过引用并入本文)。在这方面，能够自发形成异肽键的蛋白质可以表达为单独的片段，以给出肽标签和该肽标签的多肽结合伴侣，其中该两个片段能够通过异肽键形成而共价重构，从而与肽标签及其多肽结合伴侣融合的分子或组分的连接。由肽标签及其多肽结合伴侣形成的异肽键在非共价相互作用会迅速解离的条件下是稳定的，这些条件例如是经过长时间(例如数周)、高温(至少95℃)、强力或经过严格的化学处理(例如pH2-11，有机溶剂、清洁剂或变性剂)。异肽键是在羧基/羧酰胺和氨基之间形成的酰胺键，其中羧基或氨基中的至少一个在蛋白质主链(蛋白质的骨架)之外。这样的键在典型的生物学条件下是化学不可逆的，并且它们对大多数蛋白酶具有抗性。由于异肽键本质上是共价键，因此可导致某些最强的蛋白质相互作用。简而言之，两部分接头，即肽标签及其多肽结合伴侣(所谓的肽标签/结合伴侣对)可以衍生自能够自发形成异肽键的蛋白质(异肽蛋白质)，其中该蛋白质的结构域分别表达以产生包含一个与异肽键有关的残基(例如天冬氨酸或天冬酰胺)的肽标签以及包括在该异肽键中涉及的另一个残基(例如赖氨酸)和至少一个形成异肽键所需的至少一个其他残基(例如谷氨酸)的肽或多肽结合伴侣(或“捕获剂”)。混合肽标签和结合伴侣会导致标签和结合伴侣之间自发形成异肽键。因此，通过将肽标签和结合伴侣分别融合到不同的分子或组分(例如蛋白质)上，可以通过在该肽标签和结合伴侣之间形成的异肽键将所述分子或组分共价连接在一起，即在与肽标签和结合伴侣融合的分子或组分之间形成接头。肽标签/结合伴侣对(两部分接头)，称为谍标签/谍捕获剂(SpyTag/SpyCatcher)，源自于化脓性链球菌FbaB蛋白质的CnaB2结构域(Zakeri等,2012,ProcNatlAcadSciUSA109,E690-697)，并且用于多种应用，包括生物材料(Botyanszki等,2015,Biotechnologyandbioengineering112,2016-2024；Chen等,2014,ProcNatlAcadSciUSA108,11399-11404)、下一代测序(Stranges等,2016,ProcNatlAcadSciUSA113,E6749-E6756)、酶稳定作用(Schoene等,2016,Scientificreports6,21151)和疫苗开发(Brune等,2016,Scientificreports6,19234；Thrane等,2016,Journalofnanobiotechnology14,30)。但是，虽然谍标签和谍捕获剂之间的异肽键形成的速度对于纯化的成分是令人满意的，但该速度在细胞表达水平上受到限制。因此，需要开发接头，例如肽标签(“标签”)和多肽结合伴侣(“捕获剂”)对，其具有与衍生自异肽蛋白(即肽标签和多肽结合伴侣)的标签/捕获剂系统相关的有利特性，形成了如上所述的稳定而强大的共价键，其反应速率足够高以使得能够在低浓度下、特别是在细胞表达水平下有效反应。本专利技术人惊奇地确定，通过修饰(即突变)谍标签肽和谍捕获剂多肽(分别为SEQIDNO：6和7)的氨基酸序列，可以显著提高谍标签和谍捕获剂肽的反应速率。如实施例中详细讨论的，需要许多步骤来确定谍标签和谍捕获剂的反应速率是否可以提高，如果可以，则对谍标签肽和谍捕获剂多肽的哪些修饰将增加反应速率而不会对肽标签和结合伴侣对的其他理想特性产生不利影响。首先，专利技术人必须确定能够成功筛选改善谍标签和谍捕获剂，即谍标签肽(SEQIDNO：6)和谍捕获剂多肽(SEQIDNO：7)中的残基可以被修饰而基本上不降低反应速率的程度。假设谍标签肽的活性主要由一些“锚定”残基决定。由于锚定残基的突变很可能掩盖了其他位置的突变对反应速率仅产生中等程度积极影响的影响，因此假定生成肽标签的突变体文库，其中序列中任何位置均允许突变，这实际上会降低鉴定具有改进活性的肽的可能性。因此，专利技术人选择了谍标签的两个N末端残基和谍标签的六个C末端残基进行修饰，并确定允许在N末端和/或C末端添加残基。建立了随机突变的谍捕获剂多肽库，用于筛选方法。在这方面，难以基于谍捕获剂的晶体结构设计突变，因为并非所有残基都在晶体结构中可见。其次，专利技术人确定N端和C端的谍标签突变体应单独筛选，并设计合适的筛选方法以鉴定具有改进活性的突变谍标签肽和谍捕获剂多肽。因此，产生了两个在谍标签的N-或C-末端具有突变的文库的子集，并针对其提高的活性在使用谍捕获剂作为诱饵的噬菌体展示系统中进行了筛选。使用谍捕获剂突变体库(使用谍标签作为诱饵)进行单独的筛选。在噬菌体展示系统中选择参数的设计并不简单。在这方面，假设谍标签肽和谍捕获剂多肽相互作用的速率可能限制反应速率。因此，开发合适的筛选系统需要选择反应条件，在该条件下谍标签肽和谍捕获剂多肽之间的反应速率不是最佳的。谍标签和谍捕获剂之间的反应速度最快的反应条件(例如pH、温度等)的使用将分别阻碍检测突变肽和多肽相对于谍标签和谍捕获剂的反应性差异。鉴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种包含肽和多肽的两部分接头，其中：/na)所述肽包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，其中：/n(i)在位置1处的X是精氨酸或无氨基酸；/n(ii)在位置2处的X是甘氨酸或无氨基酸；/n(iii)在位置5处的X是组氨酸或苏氨酸，优选是组氨酸；/n(iv)在位置11处的X是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸，优选是丙氨酸；以及/n(v)在位置14处的X是精氨酸或赖氨酸，优选是精氨酸，/n其中当在位置1处的X无氨基酸时，在位置2处的X无氨基酸；并且/nb)所述多肽包含：/ni)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；/nii)包含SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列的(i)的一部分；/niii)与SEQ ID NO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸和以下中的一个或多个：/n1)在位置5处的苏氨酸；/n2)在位置16处的脯氨酸；/n3)在位置40处的精氨酸；/n4)在位置65处的组氨酸；/n5)在位置92处的脯氨酸；/n6)在位置100处的天冬氨酸；/n7)在位置108处的谷氨酸；和/n8)在位置116处的苏氨酸，/n其中指定的氨基酸残基位于与SEQ ID NO：2中的位置等同的位置；或/niv)包含与SEQ ID NO：101所示序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列的(iii)的一部分，其中所述氨基酸序列包含在位置10处的赖氨酸、在位置56处的谷氨酸和以下中的一个或多个：/n1)在位置16处的精氨酸；/n2)在位置41处的组氨酸；/n3)在位置68处的脯氨酸；和/n4)在位置76处的天冬氨酸，/n其中指定的氨基酸残基位于与SEQ ID NO：101中的位置等同的位置，/n并且其中所述肽和多肽能够在SEQ ID NO：1的位置10处的天冬氨酸残基和SEQ ID NO：2的位置34处或SEQ ID NO：101的位置10处的赖氨酸残基之间自发形成异肽键。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170424 GB 1706430.41.一种包含肽和多肽的两部分接头，其中：
a)所述肽包含SEQIDNO：1所示的氨基酸序列，其中：
(i)在位置1处的X是精氨酸或无氨基酸；
(ii)在位置2处的X是甘氨酸或无氨基酸；
(iii)在位置5处的X是组氨酸或苏氨酸，优选是组氨酸；
(iv)在位置11处的X是丙氨酸、甘氨酸或缬氨酸，优选是丙氨酸；以及
(v)在位置14处的X是精氨酸或赖氨酸，优选是精氨酸，
其中当在位置1处的X无氨基酸时，在位置2处的X无氨基酸；并且
b)所述多肽包含：
i)SEQIDNO：2所示的氨基酸序列；
ii)包含SEQIDNO：101所示的氨基酸序列的(i)的一部分；
iii)与SEQIDNO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸和以下中的一个或多个：
1)在位置5处的苏氨酸；
2)在位置16处的脯氨酸；
3)在位置40处的精氨酸；
4)在位置65处的组氨酸；
5)在位置92处的脯氨酸；
6)在位置100处的天冬氨酸；
7)在位置108处的谷氨酸；和
8)在位置116处的苏氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置；或
iv)包含与SEQIDNO：101所示序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列的(iii)的一部分，其中所述氨基酸序列包含在位置10处的赖氨酸、在位置56处的谷氨酸和以下中的一个或多个：
1)在位置16处的精氨酸；
2)在位置41处的组氨酸；
3)在位置68处的脯氨酸；和
4)在位置76处的天冬氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：101中的位置等同的位置，
并且其中所述肽和多肽能够在SEQIDNO：1的位置10处的天冬氨酸残基和SEQIDNO：2的位置34处或SEQIDNO：101的位置10处的赖氨酸残基之间自发形成异肽键。


2.根据权利要求1所述的两部分接头，其中所述肽包含以下中的一个或多个：
1)在位置5处的组氨酸；
2)在位置11处的丙氨酸；和
3)在位置14处的精氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置。


3.根据权利要求1或权利要求2所述的两部分接头，其中，所述肽包含SEQIDNO：3-5中任何一个所示的氨基酸序列，优选SEQIDNO：5所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的两部分接头，其中，所述多肽包含与SEQIDNO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸，以及以下所有：
1)在位置5处的苏氨酸；
2)在位置16处的脯氨酸；
3)在位置40处的精氨酸；
4)在位置65处的组氨酸；
5)在位置108处的谷氨酸；和
6)在位置116处的苏氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置。


5.根据权利要求1至3中任一项所述的两部分接头，其中所述多肽包含与SEQIDNO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸，以及以下所有：
1)在位置5处的苏氨酸；
2)在位置16处的脯氨酸；
3)在位置40处的精氨酸；
4)在位置65处的组氨酸；
5)在位置92处的脯氨酸；
6)在位置108处的谷氨酸；和
7)在位置116处的苏氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置。


6.根据权利要求1至3中任一项所述的两部分接头，其中所述多肽包含与SEQIDNO：2所示的序列具有至少80％的序列同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列包含在位置34处的赖氨酸、在位置80处的谷氨酸，以及以下所有：
1)在位置5处的苏氨酸；
2)在位置16处的脯氨酸；
3)在位置40处的精氨酸；
4)在位置65处的组氨酸；
5)在位置92处的脯氨酸；
6)在位置100处的天冬氨酸；
7)在位置108处的谷氨酸；和
8)在位置116处的苏氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置。


7.根据权利要求1至6中任一项所述的两部分接头，其中所述多肽包含以下中的一个或多个：
1)在位置12处的甘氨酸；和
2)在位置22处的苏氨酸，
其中指定的氨基酸残基位于与SEQIDNO：2中的位置等同的位置。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的两部分接头，其中所述肽和/或所述多肽缀合至核酸分子、蛋白质、肽、小分子有机化合物、荧光团、金属-配...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·豪沃思，A·基布尔，
申请(专利权)人：牛津大学创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB