造血及淋巴组织肿瘤的ctDNA高通量检测制造技术

本发明专利技术提供包括173个髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因的基因组合、针对此基因组合设计的引物组合，以及它们在高通量测序检测髓系肿瘤中的应用。本发明专利技术可以利用ctDNA对造血及淋巴组织肿瘤进行全面检测。

High throughput detection of ctDNA in hematopoietic and lymphoid tumors

【技术实现步骤摘要】
造血及淋巴组织肿瘤的ctDNA高通量检测
本专利技术属于血液病分子诊断学领域，具体涉及造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序检测。
技术介绍
造血及淋巴组织肿瘤是一类与造血系统相关肿瘤的总称，在世界卫生组织(WHO)最新的分类中，造血及淋巴组织肿瘤下分髓系肿瘤及淋系肿瘤两大类，这两类下又可分为多个分支及亚型。WHO对造血及淋巴组织肿瘤的分类依据分子生物学、细胞遗传学、细胞形态学及免疫学这个4大学科进行，其所分肿瘤亚型多达数十种，不同亚型肿瘤的治疗手段及预后情况也有所不同。因此，造血及淋巴组织肿瘤的精准分类对于其治疗及预后判断有着重要的意义。目前，随着分子生物学的发展，其在造血及淋巴组织的分型及治疗和微小残留病灶监测过程中所发挥的作用日益重要。从最经典的BCR-ABL融合基因与慢性粒细胞白血病(CML)，以及后来的JAK2、MYD88、TP53等等多个基因突变与造血及淋巴组织肿瘤的关系被发现，目前已经有多个基因被不同文献所报道与造血及淋巴组织肿瘤所相关。而基于这些基因的突变位点检测，一大部分患者均需要涉及到组织或者骨髓活检的方法，而这两类方法均属于有创检测，存在取材困难、不利于随时监控等缺点，使得基于组织或骨髓活检的基因检测在临床应用具有一定的局限性。液体活检(Liquidbiopsy)是近年来兴起的一种新型技术，该技术通过抽取受检者的外周血并检测外周血中的游离DNA(cfDNA/ctDNA)、肿瘤细胞或者肿瘤细胞释放的外泌体等物质，从而对受检者本身疾病的发生及进展、基因突变等等情况进行检测，达到辅助临床治疗的目的。液体活检主要特点为取材容易，只需抽取患者外周血即可进行检测，基于无创这一特点，该技术问世以来就受到科研界广泛关注。目前较为成熟的检测技术是基于游离肿瘤DNA(ctDNA)进行检测的二代测序技术以及数字PCR技术，而在实际应用中，基于二代测序技术的ctDNA相关检测因其检测范围广而大量应用于液体活检领域相关的科研及临床当中。目前，国内和国际上针对ctDNA的二代测序已经有一些成熟的技术，如多重PCR技术以及杂交捕获技术，多重PCR技术具备所需起始DNA量低，操作简便等优点，而杂交捕获技术则能够在一定程度上对拷贝数变异(CNV)以及一部分外显子缺失位点进行检测。此外，近年诞生的双端分子标签技术、滚环复制技术以及著名的AMP技术，使得目前的ctDNA液态活检的检测灵敏度扩展了一个数量级，达到了0.1％。并且在诸如肺癌，弥漫大B淋巴瘤等癌种中的各类数据均表明，ctDNA在突变检测上与组织样本存在高度符合性，甚至可以较肿瘤组织活检更早预测肿瘤的复发及反映原发肿瘤基因组全貌。这一系列的技术及研究结果的出现，使得基于ctDNA的液态活检得以应用于临床检测。ctDNA液态活检技术目前主流的肿瘤临床应用领域仍集中在肺癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌等少数高发癌种上，而造血淋巴组织肿瘤的相关应用仍较为缺乏，且尚未见基于ctDNA的造血及淋巴组织肿瘤的测序产品。
技术实现思路
本专利技术的一方面提供髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括选自表1所示的基因的任意一个或更多个基因。表1173个基因及其对应的NCBIGenBank编号在一些实施方案中，所述基因组合包括表1所示的全部173个基因。在一些实施方案中，所述基因组合用于制备能够特异性检测所述基因组合的引物组合，所述能够特异性检测所述基因组合的引物组合用于构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库。因此，本专利技术的另一方面提供能够特异性检测所述基因组合的引物组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用。在一些实施方案中，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。表22720对引物序列在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。本专利技术的另一方面提供引物组合，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。本专利技术的另一方面提供构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以从外周血中提取的肿瘤细胞游离DNA(ctDNA)为模板，使用能够特异性检测上述基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物；(2)向步骤(1)获得的混合物添加NGS测序标签(index)，并在两端连接测序所需的接头，然后纯化获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即获得高通测量序文库(Library)。在一些实施方案中，所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部2720个引物对。在一些实施方案中，多重PCR反应的程序是：99℃保持2分钟；23个循环，每个循环99℃15秒，60℃4分钟；10℃保持。本专利技术的另一方面提供检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库，所述文库是通过上述方法获得的文库。本专利技术的另一方面提供上述基因组合在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本专利技术的另一方面提供能特异性检测上述基因组合的引物组合在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本专利技术的另一方面提供上述引物组合或上述高通量测序文库在制备造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂或造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒中的应用。本专利技术的另一方面提供造血及淋巴组织肿瘤诊断试剂盒，其包含上述引物组合。本专利技术的有益效果在于：(1)本专利技术首次利用ctDNA对造血及淋巴组织肿瘤进行全面检测。(2)低起始量的同时能检测广泛位点：本专利技术采用多重PCR法构建文库，其优点在于，相比于传统的Taqman-qPCR法检测突变，多重PCR法能一次性检测几百、上千个片段及相关位点，具有传统PCR及ddPCR无法达到的通量。此外，多重PCR法构建DNA文库，仅需要最低1ng的DNA起始量，与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括选自下表所示基因的任意一个或更多个基因：/n

【技术特征摘要】
1.髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括选自下表所示基因的任意一个或更多个基因：








2.能够特异性检测髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合的引物组合在构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括选自下表所示基因的任意一个或更多个基因：








3.根据权利要求2的应用，其中所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。


4.用于检测造血及淋巴组织肿瘤的引物组合，其中所述引物组合包括选自表2所示的2720个引物对中的任意一个或更多个引物对。


5.构建检测造血及淋巴组织肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以从外周血中提取的肿瘤细胞游离DNA为模板，使用能够特异性检测髓系肿瘤及淋巴组织肿瘤相关基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑峰，何旭华，肖敏，张炜，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44