噬血细胞综合征的高通量测序检测制造技术

本发明专利技术提供包括26个基因在内的基因组合、针对此基因组合设计的引物组合，以及它们在高通量测序检测噬血细胞综合征中的应用，通过对构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，可为噬血细胞综合征等疾病的诊断及治疗提供依据。

Detection of hemophagocytic syndrome by high throughput sequencing

【技术实现步骤摘要】
噬血细胞综合征的高通量测序检测
本专利技术属于血液病分子诊断学领域，具体涉及噬血细胞综合征的高通量测序检测。
技术介绍
噬血细胞综合征(hemophagocyticsyndrome，HPS)又称噬血细胞性淋巴组织细胞增多症(HemophagocyticLymphohistiocytosis，HLH)，是一种由原发或继发性免疫异常导致的过度炎症反应综合征。其免疫调节异常主要由淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞系统异常激活、增殖，分泌大量细胞因子而引起的一系列炎症反应。该病临床以持续发热、肝脾肿大、全血细胞减少以及骨髓、肝、脾、淋巴结组织发现噬血现象为主要特征。2018年《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中指出，根据病因不同，噬血细胞综合征分为有特定遗传/基因缺陷的原发性HLH和由感染(如EB病毒感染)、肿瘤、自身免疫性疾病等引起的继发性HLH。原发性HLH是由于患者体内基因某一位点或多位点突变从而导致免疫调节功能缺陷的一种疾病，多伴有常染色体或性染色体隐性遗传。原发性HLH根据缺陷基因的特点又可分为家族性HLH、免疫缺陷综合征相关HLH和EB病毒(EBV)驱动HLH。其中，家族性HLH共有5个亚型，包括FHL-1、FHL-2、FHL-3、FHL-4和FHL-5。FHL-1相关的缺陷基因及编码蛋白至今仍未被确定，而FHL-2至FHL-5则分别对应了PRF1、Unc13D、STX11及STXBP2基因及其相关编码的蛋白。目前，已确定多种基因缺陷与原发性HLH有关，如HPLH1基因、穿孔素基因(PRF1)、UNC13D基因、STX11基因、STXBP2基因等。而免疫缺陷综合征相关HLH则包括了Chediak-Higashi综合征(CHS，LYST基因突变)、Hermansky-Pudlak综合征HLHII型(AP3B1基因突变)、Griscelli综合征(GS)2型(RAB27A基因突变)、X连锁淋巴增殖性疾病(XLP)1型(SH2D1A基因突变)和2型(BIRC4基因突变)等疾病种类。在EBV驱动的HLH中，则包含了SH2D1A、BIRC4、ITK、MAGT1等基因的突变。继发性HLH可出现于任何年龄阶段，其主要病因包括：(1)感染因素：如病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体及寄生虫等；(2)肿瘤性疾病：如淋巴瘤、白血病等；(3)风湿性疾病：如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬化并、干燥综合征等。HLH是一种潜在致死性综合征，源自淋巴细胞和巨噬细胞的异常活化，以淋巴细胞异常活化，持续免疫活性及高水平细胞因子为特征。其临床治疗需要精准的诊断进行辅助。在分子生物学发展日新月异的今天，临床分子诊断在疾病的治疗中越发扮演重要角色。在2018年《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中：1)所有确诊HLH的患者都应进行功能学检查，包括NK细胞活性和脱颗粒功能检测(NK细胞和CTL细胞膜ΔCD107a)，穿孔素、颗粒酶B、SAP、XIAP等与HLH缺陷基因相对应的蛋白表达量的检测。对于检测结果存在明确异常的患者应及时送检基因测序。2)发病年龄≤2岁的患者，应送检基因测序。3)未找到明确病因的患者，应送检基因测序。4)反复发作的患者，应送检基因测序。并且共识中列出了12个检测基因清单：PRF1、UNC13D、STX11、STXBP2、Rab27a、LYST、SH2D1A、BIRC4、ITK、AP3B1、MAGT1、CD27，但由于目前学科发展迅速，共识中的基因清单已经不能完全满足目前临床对于HLH基因诊断的需求。二代测序技术是一种基于基因芯片的大批量检测基因序列或者基因表达量等信息的技术，目前该技术已广泛渗透到临床及科研领域当中，并占据重要位置。与传统的一代测序及荧光定量PCR检测相比，二代测序通量大，单位点检测成本低，可以在一次实验中同时检测大批量基因。目前，虽然已经有少数基于二代测序技术对HLH疾病进行诊断的基因PANEL试剂盒，但基本上都存在着检测不全面的问题，甚至部分基因panel中检测基因数量少于《噬血细胞综合征诊治中国专家共识》中推荐的12个基因，这极大的影响了相关疾病的诊断和治疗。此外，目前市场上的基因Panel均未全面涉及到穿孔素颗粒酶通路相关的基因，而该通路与噬血细胞综合征有着重要相关性，如果不能全面检测穿孔素颗粒酶相关基因，则影响对噬血细胞综合征的精确诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基因组合及其检测引物库在构建检测噬血细胞综合征的高通测序文库中的应用，通过对构建的高通量测序文库进行测序以及数据分析，可为噬血细胞综合征等疾病的诊断及治疗提供依据。本专利技术的一方面提供基因组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG。在一些实施方案中，所述基因组合用于制备能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合，所述能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合用于构建检测嗜血细胞综合征的高通量测序文库。因此，本专利技术的另一方面提供能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合在构建检测嗜血细胞综合征的高通量测序文库中的应用。在一些实施方案中，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQIDNO:1-SEQIDNO:678)。表1339对引物序列本专利技术的另一方面提供引物组合，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQIDNO:1-SEQIDNO:678)。本专利技术的另一方面提供构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以待测DNA为模板，使用能够特异性检测上述基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物；(2)向步骤(1)获得的混合物添加NGS测序标签，然后在两端连接测序所需的接头，利用磁珠进行纯化，获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即获得高通量测序文库。在一些实施方案中，所述引物组合包括表1所示的全部引物(即SEQIDNO:1-SEQIDNO:678)。在一些实施方案中，多重PCR反应的程序是：99℃保持2分钟；19个循环，每个循环99℃15秒，60℃2分钟；10℃保持。在一些实施方案中，所述待测DNA是从骨髓或外周血中提取的基因组DNA。本专利技术的另一方面提供检测噬血细胞综合征的高通量测序文库，所述文库是通过上述方法获得的文库。本专利技术的另一方面提供能够特异性检测上述基因组合的引物组合或探针组合在制备噬血细胞综合征诊断试剂或噬血细胞综合征诊断试剂盒中的应用。本专利技术的另一方面提供上述基因组合、上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.基因组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG。/n

【技术特征摘要】
1.基因组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG。


2.能特异性检测与噬血细胞综合征相关的基因组合的引物组合或探针组合在构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是GZMB、GNLY、ARF6、SRGN、STX11、PRF1、STXBP2、UNC13D、AP3B1、LYST、RAB27A、BLOC1S6、SH2D1A、CD27、MAGT1、XIAP、ITK、PIK3CD、LAMP1、CORO1A、CARD11、MCM4、CTPS1、PRKCD、STK4和IL2RG。


3.根据权利要求2的应用，其中所述引物组合包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:678所示的引物。


4.用于检测噬血细胞综合征的引物组合，其中所述引物组合包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:678所示的引物。


5.构建检测噬血细胞综合征的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以待测DNA为模板，使用能够特异性检测与噬血细胞综合征相关的基因组合的引物组合进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物，所述基因组合包括26个基因，所述26个基因是...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑峰，何旭华，肖敏，张炜，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44