一种弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒，属于基因检测与疾病诊断领域。本发明专利技术发现了KCNG1基因与弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的发生存在一定的联系，通过检测KCNG1基因是否存在G185A突变可用于DLBCL的辅助诊断。本发明专利技术的DLBCL基因突变检测试剂盒所检测基因包含了KCNG1基因，以及与现有技术已确定与DLBCL发生有关的MYD88、CD79B、EZH2、B2M、NOTCH2、STAT6、TP53基因。本发明专利技术为DLBCL的辅助诊断提供了新的材料；本发明专利技术的试剂盒能够检测一次性检测上述基因的突变情况，为DLBCL的前期诊断、分型判定、预后分层及用药指导提供了依据。

A Kit for Detecting Gene Mutation in Diffuse Large B-cell Lymphoma

【技术实现步骤摘要】
一种弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒
本专利技术属于基因检测与疾病诊断领域，具体涉及一种弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒。
技术介绍
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DiffuselargeB-celllymphoma，DLBCL)是一种常见的非霍奇金淋巴瘤，约占非霍奇金淋巴瘤的50％，占淋巴瘤整体发病的30％。DLBCL首次在1994年被定义了该分类，并在后续的世界卫生组织(WHO)指南中不断的补充其新亚型。在2008年的WHO指南中将DLBCL定义为：弥漫增生的大B细胞恶性肿瘤，瘤细胞核大于或等于正常吞噬细胞核，或大于正常淋巴细胞的2倍。DLBCL在临床上表现出一定的异质性，并以迅速增大的无痛性肿块为典型表现，肿瘤主要原发于淋巴结内，但有30％左右患者发生于淋巴结外，一般呈局限性病灶。DLBCL的临床过程呈侵袭性，多为单个淋巴结或结外病灶出现迅速长大的局限性肿块，约1/3的患者有全身症状。DLBCL病因复杂，可原发或者从其他低度侵袭性淋巴瘤转化而来(如滤泡性淋巴瘤、慢性B淋巴细胞白血病/小淋巴瘤细胞淋巴瘤等)。DLBCL下属亚型又分数种，包括非特指型DLBCL、T细胞/组织细胞丰富的DLBCL、原发于中枢神经系统的DLBCL、原发于皮肤的DLBCL(腿型)，及老年人EB病毒阳性的DLBCL等。其中又以非特指型DLBCL(DLBCL-NOS)为最常见类型，该型DLBCL主要有转化的大淋巴样细胞组成。根据形态学特点，可分为常见形态变异型及罕见形态变异型，前者包括中心母细胞性、免疫母细胞性、间变大细胞性淋巴瘤、富于T细胞/组织细胞性的B细胞淋巴瘤等；后者包括浆母细胞性淋巴瘤及表达间变性淋巴瘤激酶(ALK)全长的淋巴瘤。基于人类基因组计划的完成，近年来医学进入了飞速发展阶段。针对于DLBCL的研究也取得了重要成果。2000年cDNA微阵列技术被首次运用于DLBCL分型，根据基因表达谱将DLBCL分为两类，生发中心B细胞样(GCB型)和活化的外周血B细胞样(ABC型)。两型DLBCL来源于不同分化发育阶段的B细胞：GCB型起源于生发中心细胞，而ABC型来自后生发中心细胞(PGC)。随后又发现一类基因表达与GCB型和ABC型不同，但预后与ABC型无显著差异的第3型(与ABC型合称非GCB型)。GCB型预后明显较好，治疗后GCB型和非GCB型的5年生存率分别为76％和34％。在分子方面，DLBCL已经有多篇研究报告其相关的分子特征。约3/4的DLBCL存在着基因重排，BCL2、BCL6、MYC等属于DLBCL的典型重排基因。而在基因突变方面，DLBCL已经被研究报道了一系列的突变基因。诸如著名的MYD88基因L265P突变位点、EZH2的Y646突变位点和CD79B基因的Y196突变位点等等。这些突变位点影响着DLBCL的分型判定、预后分层以及药物敏感性等等。例如EZH2的Y646突变常见于GCB型DLBCL中，而GCB型DLBCL普遍研究表明其疾病预后较好，具有该突变的患者可以尝试采用Tazemetostat(临床2期)等抑制剂进行治疗。另外诸如CD79B基因的Y196突变常见于ABC型弥漫大B细胞淋巴瘤中，该亚型预后较差，具有该突变的患者可能对伊布替尼、fostamatinib等药物敏感。整体而言，分子水平的突变检测对于DLBCL的整体诊断评估意义巨大，随着研究的不断深入，一些新的基因及相关突变模式、突变位点对DLBCL的影响机制也随之被发现。高通量测序技术，又称为下一代测序技术(Nextgenerationsequence，NGS)是近年来发展成熟的一项革命性技术。一次性对一个样本进行数十个数百个基因的检测，能良好的对疾病的分子特征进行整体评估。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供KCNG1基因在制备DLBCL辅助诊断试剂盒中的应用。本专利技术的目的还在于提供包含KCNG1基因在内的基因组合在制备DLBCL基因突变检测试剂盒中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术发现了多例DLBCL患者的KCNG1基因存在G185A突变，表明KCNG1基因与DLBCL的发生存在一定的联系，通过检测KCNG1基因是否存在G185A突变可用于DLBCL的辅助诊断。基于此，KCNG1基因具有制备DLBCL辅助诊断试剂盒的应用。进一步地，扩增KCNG1基因的引物也具有制备DLBCL辅助诊断试剂盒的应用。更进一步地，一种DLBCL辅助诊断试剂盒，包含扩增KCNG1基因的引物。现有技术已确定与DLBCL发生有关的基因突变包括MYD88、CD79B、EZH2、B2M、NOTCH2、STAT6、TP53等基因的突变，与本专利技术发现的与DLBCL发生相关的KCNG1基因结合，检测这些基因的突变情况对于DLBCL的诊断、分型判定、预后分层以及药物选择等有重大意义。基于此，本专利技术提供一种基因组合在制备DLBCL基因突变检测试剂盒中的应用，所述的基因组合包括MYD88、CD79B、EZH2、B2M、NOTCH2、STAT6、TP53、KCNG1基因。进一步地，扩增该基因组合中各基因的引物也具有制备DLBCL基因突变检测试剂盒的应用。高通量测序技术能够一次性对一个样本进行数十到数百个基因进行检测，本专利技术进一步提供一种基于高通量测序技术的DLBCL基因突变检测试剂盒，以检测包含MYD88、CD79B、EZH2、B2M、NOTCH2、STAT6、TP53、KCNG1基因在内的基因组合中各基因的突变情况。为了检测上述基因组合中各基因的突变情况，需要建立测序文库进行测序。以采用多重PCR法构建测序文库为例，本专利技术设计了检测这些基因全部外显子区域的引物库，经过了引物及引物之间的错配评估及大量实验验证，将导致错配发生的引物去除并引入新的不会导致引物间错配的引物序列，得到由表1中的引物组成的引物库，保证了基因组合中各基因的高检测质量，保证了每个特异性目的片段均能正常扩增。表1引物信息上述引物库能够用于制备检测DLBCL基因突变的高通量测序文库以及DLBCL基因突变检测试剂盒。一种制备检测DLBCL基因突变的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以待检样本的基因组DNA为模板，使用引物库中的引物进行多重PCR反应，得到含有DNA片段集合的混合物；(2)向步骤(1)获得的混合物添加NGS测序标签(index)，然后在两端连接测序所需的接头，利用磁珠进行纯化，获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即获得高通量测序文库。进一步地，步骤(2)中的NGS测序标签(index)和接头，采用Illumina通用index、Illumina通用接头，获得高通量测序文库的结构为：TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-XXXXXXX-AAAAAAAAAA-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC。其中，第一部分以及最后一部分碱基序列为Illumina测序所需的两端接头碱基序列，“XXXXXXXX”为不同序列的index，用以区分不同样本的DNA数据，“AAAAAAA”为PCR产物，其长度在150bp左右。另外，接头序列包括并不仅限于上述序列，可以为其它Illumina对应接头序列。所述的NGS测序标签(ind本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.KCNG1基因在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒通过检测KCNG1基因是否存在G185A突变对弥漫性大B细胞淋巴瘤进行辅助诊断。

【技术特征摘要】
1.KCNG1基因在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂盒通过检测KCNG1基因是否存在G185A突变对弥漫性大B细胞淋巴瘤进行辅助诊断。2.扩增KCNG1基因的引物在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤辅助诊断试剂盒中的应用。3.一种弥漫性大B细胞淋巴瘤辅助诊断试剂盒，其特征在于：包含扩增KCNG1基因的引物。4.一种基因组合在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒中的应用，其特征在于：所述的基因组合包括MYD88、CD79B、EZH2、B2M、NOTCH2、STAT6、TP53、KCNG1基因。5.扩增权利要求4中所述的基因组合中各基因的引物在制备弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变检测试剂盒中的应用。6.一种引物库在制备检测弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变的高通量测序文库中的应用，其特征在于：所述的引物库中引物信息如下表：所述的弥漫性大B细胞淋巴瘤基因突变包括MYD88、C...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱洲杰，陈少平，卫晓光，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44