热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法技术

本发明专利技术涉及一种热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，属于生物安全与生物防治技术领域，具体包括首先调查了不同高温和时间条件下，莲草直胸跳甲不同发育阶段，如卵，1龄，2龄，3龄幼虫，蛹及成虫的存活率，通过其耐热性差异比较，选取耐热性最差的虫态进行了短时高温下整个种群在各发育阶段的存活、寿命、繁殖力等生命参数的观察；通过明确莲草直胸跳甲高温耐受性最差的虫态和影响的关键温度,然后系统鉴定莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因。最后通过实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系，探讨热激蛋白基因诱导表达的最大值是否可以作为一种生物指示剂来指示物种对温度的耐受极限。本发明专利技术能够准确了解引进昆虫对温度的耐受性，大大缩短昆虫引进周期。

Detection of Insect Temperature Tolerance Using Heat Shock Protein Gene as Molecular Marker

【技术实现步骤摘要】
热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法
本专利技术涉及一种热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，属于生物安全与生物防治

技术介绍
热激蛋白(Heatshockproteins，HSPs)是细胞或生物体受到热激或其它应激原作用下新合成或含量增加的一类遗传上高度保守的蛋白，在生物体中普遍存在，在细胞生长、发育、分化、基因转录等功能方面发挥重要的作用。根据分子量的大小和氨基酸同源性的差异，热激蛋白可以划分为几个家族：Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40以及小分子Hsp(sHsp)。由于热激蛋白基因响应各种生物与非生物胁迫，且反应灵敏，因此可以作为指示各种胁迫的分子标记物。当生物体受到胁迫时，HSPs往往会迅速做出应激反应，因此使用HSPs的检测比传统的基于生长速率，死亡率、繁殖率等测试更加超前、灵敏和迅速。例如当生物体受到环境污染时，便可以提前预警预报，从而对生态环境做出准确的评估。目前已有研究通过检测生物体内HSPs的变化来对土壤污染、大气污染等进行检测评估(Kohler等.Validationofhsp70stressgeneexpressionasamarkerofmetaleffectsinDerocerasreticulatum(Pulmonata):correlationwithdemographicparameters，EnvironnentalToxicologyandChemistry，1998；17(11):2246-2253.Webb和Gagnon.Thevalueofstressprotein70asanenvironmentalbiomarkeroffishhealthunderconditions,2008，DOI10.1002/tox)，因此热激蛋白是一种很有潜力的环境污染分子标记物。热激蛋白作为莲草直胸跳甲温度耐受的分子标记物目前研究很少。莲草直胸跳甲是世界性恶性杂草—喜旱莲子草的天敌昆虫，该天敌昆虫温度适应性较差，温度的变化直接影响其地理分布及控草效果。本专利技术对温度胁迫下莲草直胸跳甲的生命参数和热激蛋白基因的表达模式进行研究。探讨热激蛋白基因作为一种分子标记物应用于昆虫温度耐受性检测评估的可行性，为开发热激蛋白基因在昆虫领域的应用奠定理论基础。
技术实现思路
为解决现有技术存在的技术问题，本专利技术提供了一种能够准确了解引进昆虫对温度的耐受性，大大缩短昆虫引进周期的热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案为热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，a、昆虫样品的高温处理收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；在进行生命表数据分析时，根据年龄-阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX-MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄-阶段特异性存活率，计算如下：其中n01是在生命表试验开始时卵的数量，sxj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，nxj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；雌性年龄-阶段特异性繁殖力fx4计算公式如下：其中Ex表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，nx4是雌性成虫存活到第x天的数量；根据Chi和Liu(BulletinoftheInstituteofZoologyAcademiaSinica,24(2):225-240)，净生殖率R0表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目,lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；lx和mx的计算如下：用迭代对分法和Euler-Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝er，用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(EnvironmentalEntomology,17(1):26-34)证明的R0和F之间的关系，该方法不会影响lx或mx，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对PairedBootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较；c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DNA是否去除干净，如没有完全去除，增加DNaseI的量和反应的时间直至完全去除，然后-80℃保存备用；最后在再对RNA进行反转录和实时荧光定量PCR；在进行实时荧光定量PCR时，设计27个HSP基因和内参基因β-actin的PCR引物，实时荧光定量PCR的反应总体系为20μL，其中包括10μL的2×SelectMasterMix(AppliedBiosystems)，2μM的基因特异性引物和2μL的莲草直胸跳甲cDNA模板，整个反应在ABI7500上进行，相对定量的数据使用ABI7500SDSv2.2.6软件生成，每个样品3次技术重复，β-actin作为内参基因，热激蛋白基因mRNA的相对表达量数据采用2-△△CT法处理计算；相关热循环参数设置如下：优选的，所述步骤c中在进行RNA的提取时，1)将各温度处理虫卵样品在液氮中充分研磨后加入到1.5mlRNase-free的EP管中，样品总量为60mg；2)向RNase-freeEP管中加入1mlTrizon，10μlβ-巯基乙醇，用移液器吹打混匀后，室温静置10min，在4℃下12本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，a、昆虫样品的高温处理收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；在进行生命表数据分析时，根据年龄‑阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX‑MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄‑阶段特异性存活率，计算如下：...

【技术特征摘要】
1.热激蛋白基因作为分子标记物检测昆虫温度耐受性的方法，其特征在于：按照以下步骤进行，a、昆虫样品的高温处理收集莲草直胸跳甲12h内所产的卵，按照6个不同的发育阶段卵、1龄幼虫、2龄幼虫、3龄幼虫、蛹、成虫，将卵分为6组，各组卵均置于25℃、相对湿度85±5％、光照周期14L:10D的养虫室中饲养，处理温度为32.5℃，35℃，37.5℃，40℃，42.5℃，45(±0.5℃)，处理时间为1h，3h，5h，每个处理为5个重复，每个重复供试虫量100～150头，热处理结束后，将热暴露后的莲草直胸跳甲转移至25℃养虫室继续饲养；b、短时高温对莲草直胸跳甲种群的影响对经过短时高温处理的各虫态的存活率数据进行分析，选取关键的热敏感虫态、温度及时间处理组合进行生命表观察和数据记录，然后对生命表数据分析，最终明确高温对莲草直胸跳甲种群的影响；在进行生命表数据分析时，根据年龄-阶段两性生命表的理论和方法，利用http://140.120.197.173/Ecology/Download/TWOSEXMSChart.rar所提供的计算机程序TWOSEX-MSChart，分析了莲草直胸跳甲不同发育阶段的存活率、寿命和繁殖力等所有原始数据；因为莲草直胸跳甲是群体饲养的，所以记录了在每个阶段，存活至年龄为x的个体的数量；其中涉及的生命参数包括特定年龄-阶段特异性存活率，计算如下：其中n01是在生命表试验开始时卵的数量，sxj，表示新孵化个体存活至第x天和第j阶段的比率，nxj是存活到第x天和第j阶段的跳甲数量；雌性年龄-阶段特异性繁殖力fx4计算公式如下：其中Ex表示所有雌性成虫(第4阶段)在x天时产卵的总数，nx4是雌性成虫存活到第x天的数量；根据Chi和Liu(BulletinoftheInstituteofZoologyAcademiaSinica,24(2):225-240)，净生殖率R0表示一个体在其生命期内可以产生的后代的总数，计算公式为：其中m是生命阶段的数目,lx是年龄特异性存活率(新产的卵存活到第x天的概率)，mx是年龄特异性繁殖力(第x天个体的平均繁殖力)；lx和mx的计算如下：用迭代对分法和Euler-Lotka方程，估算了年龄指数从0开始的内禀增长率r，公式如下：周限增长率λ，平均世代周期T等，计算如下：λ＝er，用Bootstrap法估计各处理种群参数的标准误，该方法需要每个个体的寿命和雌成虫的日繁殖力，每个个体的寿命和性别可以根据个体的存活状态来计算；雌虫的平均繁殖力可以根据每头雌虫每天产卵的数量来估算；根据Chi(EnvironmentalEntomology,17(1):26-34)证明的R0和F之间的关系，该方法不会影响lx或mx，因此，也不会影响群体参数；由于雌性寿命不同，这种方法仍然可以揭示其对雌性繁殖力的影响，对于发育时间，寿命，繁殖力和种群参数的方差和标准差估算，均采用采用Bootstrap方法，进行100,000次抽样，处理间的差异用配对PairedBootstrap方法进行检验(B＝100,000)，基于95％置信区间进行比较；c、实时荧光定量PCR分析热激蛋白基因与温度适应性的关系鉴定完莲草直胸跳甲所有热激蛋白家族基因后，提取热敏感虫态(卵)不同温度条件下的总RNA，提取完成后，利用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度，然后-80℃保存备用；然后再对RNA进行纯化处理，处理完成后，利用电泳检测基因组DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾栋，袁晓芳，王锦华，张彬，刘艳红，胡军，马瑞燕，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14