一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。它包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，样品吸收垫、反应膜、吸水垫依次固定于底板上；试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；检测区包被链霉亲和素；质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，质控探针与金标探针序列互补；引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer；金标探针为胶体金标记的探针；探针与下游引物的tail互补，同时与试纸条的质控探针序列互补。本发明专利技术能实现简单快速低成本的现场检测牦牛奶是否掺假。

A Kit for Rapid Identification of Adulteration in Yak Milk

【技术实现步骤摘要】
一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒
本专利技术涉及生物
中的检测试剂盒，特别是涉及一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。
技术介绍
随着社会的发展、生活水平逐渐提高，人们不再仅仅满足于普通的牛奶制品，而更青睐产地污染少、营养更丰富的奶制品，如牦牛奶。牦牛作为高海拔地区的生物，它们的生活环境无污染。因此牦牛奶有着普通牛奶所不能比拟的特点。牦牛奶中免疫球蛋白含量高，能够帮助人体调节免疫力；同时牦牛奶中富含天然乳钙和人体所必需的18种氨基酸、共轭亚油酸、а-亚麻酸、花生四烯酸、维生素H等多种稀有营养成分。正是由于牦牛奶的高营养价值所带来的良好的商业前景，很多不法商贩为了谋取暴利，往往人为的向牦牛奶中掺入普通牛奶。这种以假充好、名不副实的欺诈行为不仅损害消费者的权益，扰乱了市场秩序，而且牵涉到了人体健康。因此，建立准确、灵敏、快速的乳制品掺假鉴别方法，对保障乳及乳制品安全、维护消费者权益都具有重要的现实意义。目前很多乳制品的检测方法，这些方法的主要研究对象为蛋白质和DNA。蛋白质是生命的物质基础，不同物种的肌肉组成拥有特定的氨基酸序列和组成成分以及特定的蛋白质三维结构，特别适用于物种鉴别。乳及乳制品中含有大量的蛋白质，不同的乳中蛋白质的结构不同。因此，以蛋白质为基础的检测方法是最常用的乳制品掺假鉴别方法，主要包括凯氏定氮法、电泳法、酶联免疫法、色谱法、光谱法。DNA作为遗传物质是生命最基本物质之一，存在于生物大多数细胞中，具有一定的热稳定性和物种特异性，因此相比其他方法具有更高的分辨率、特异性和敏感度。由于每种动物的DNA序列都具有唯一性和稳定性，且不同组织器官的DNA序列相同，因此可以从不同部位提取DNA。目前DNA分析主要通过基因组DNA和线粒体DNA。聚合酶链式反应PCR是目前食品检测应用最广泛的技术，具有高效、快速、极高的灵敏度和分辨率的特点，不仅适用于动物的种类鉴别，还可用于各种加工产品中的检测。重组酶聚合酶技术是近几年发展的热点，无论是从稳定性、灵敏度以及反应时间，RPA技术明显优于其他检测技术，它主要依赖于三种酶：重组酶(Recombinase)、单链结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶。整个RPA反应过程进行得非常快，一般在恒定37℃反应20分钟内即可检测扩增产物。与之相同的重组酶介导链替换核酸扩增技术(简称RAA技术)降低了RPA技术的成本，同样值得发展。试纸条是一种简单方便灵敏的现场快速检测产品，已被广泛应用于检测行业。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒。本专利技术为了开发一种适于基层质检人员进行牦牛奶产品掺假鉴别的技术，本专利技术设计了牦牛的特异性RAA引物，开发了一种基于RAA试纸条技术的牦牛奶鉴别试纸条技术及其试剂盒。相比使用抗原抗体的方法进行试纸条显色反应，该方法借助于双链互补原则，降低了实验材料的成本，实现简单快速低成本的现场检测。本专利技术提供的一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，该试剂盒包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与金标探针序列互补；所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer；所述引物对用于扩增牦牛特异性基因；所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针序列互补。本专利技术中，C3spacer指的是3个亚甲基。上述的试剂盒中，所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。上述的试剂盒中，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。上述的试剂盒中，形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/mL～10mg/mL，具体可为5mg/mL或4mg/mL～8mg/mL；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；所述质控探针的浓度可为100μM；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1～2小时。上述的试剂盒中，所述缓冲溶液为TEBuffer；制备所述金标探针的步骤如下：将胶体金溶液与所述探针，在避光下放置反应；然后加PB缓冲液，并加NaCl水溶液稀释，放置反应，即得所述金标探针。上述的试剂盒中，所述胶体金溶液中胶体金的粒径为13～25nm，所述探针的浓度为100μM；所述胶体金溶液与所述探针的体积比为25～50：1；在所述避光下放置反应时间为16～24h；所述PB缓冲液的浓度为10mM，所述探针与所述PB缓冲液的体积比为1:2.8；加2MNaCl水溶液将体系稀释至0.3M，然后反应的时间为8～12h；得到所述金标探针的后处理步骤如下：离心，除上清；再用所述NaCl水溶液和所述PB缓冲液冲洗两次，然后重悬于NaCl水溶液和PB缓冲液中，备用。本专利技术还提供了一种利用上述的试剂盒快速检测牦牛奶中DNA的方法，包括如下步骤：(1)具有上述引物对扩增待测样品的核酸提取液，得到扩增产物；(2)所述扩增产物与所述金标探针和缓冲溶液混合反应，然后滴加至所述试纸条的样品吸收垫上，检测结果如下：1)当所述检测区显色，且所述质控区也显色，则所述待测样品检测结果为阳性；2)当所述检测区不显色，且所述质控区显色，则所述待测样品检测结果为阴性；3)当所述质控区不显色，则所述试纸条无效，需要用新的所述试纸条重新测定。本专利技术中，所述待测样品检测结果为阳性，即为所述待测样品检测到牦牛奶中DNA，说明所述待测样品牦牛奶没有掺假；所述待测样品检测结果为阴性，即为所述待测样品没有检测到牦牛奶中DNA，说明所述待测样品牦牛奶掺假。本专利技术中，所述扩增是将待测样品的核酸提取液，置于具有上述引物对的RAA反应体系进行RAA反应进行。反应过程：37℃20min。本专利技术中，所述待测样品扩增后若产物中有目标序列，则试纸条的检测区上的链霉亲和素抓住上游引物的生物素，下游引物的tail与金标探针互补，从而在检测区显色；若无目标序列，检测区不能显色，在质控区Control序列与金标探针互补，进行质控。本专利技术上述的方法步骤(1)中，所述扩增产物的纯化使用柱式纯化试剂盒进行产物纯化目的片段。上述的方法步骤(1)中，所述待测样品与所述引物对的体积比为1:2；步骤(2)中，所述扩增产物、所述金标探针和所述缓冲溶液的体积比为2:5:25。本专利技术中，所述待测样品的核酸提取液按照如下步骤：取奶样品，离心，去除脂肪和上清，加PBS缓冲液，再次离心，反复两次，将沉淀重悬于PBS缓冲液，按照血液核酸提取试剂盒说明书进行提取，得到100μL的所述待测样品的核酸提取液。本专利技术还提供了一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试纸条，包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与所述金标探针序列互补；所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列 tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3 spacer，所述引物对用于扩增牦牛特异性基因；所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针的序列互补。

【技术特征摘要】
1.一种快速鉴别牦牛奶是否掺假的试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括试纸条、引物对、金标探针和缓冲溶液；所述试纸条包括样品吸收垫、反应膜、吸水垫和底板；沿样品流动方向，所述样品吸收垫、所述反应膜、所述吸水垫依次固定于所述底板上；所述试纸条的反应膜上包括检测区和质控区；所述检测区包被有链霉亲和素；所述质控区包被连接有链霉亲和素或生物素的质控探针，所述质控探针与所述金标探针序列互补；所述引物对为5'端修饰有生物素的上游引物和下游引物5'端与一段序列tail相连，所述下游引物与序列tail两段序列中间修饰C3spacer，所述引物对用于扩增牦牛特异性基因；所述金标探针为胶体金标记的探针；所述探针与所述下游引物的tail互补，同时与所述试纸条的质控探针的序列互补。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控探针的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的上游引物和所述的下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：形成所述检测区的所述链霉亲和素的浓度可为4mg/mL~10mg/mL，具体可为5mg/mL；形成所述质控区的所述链霉亲和素或生物素的浓度可为1mg/mL；所述质控探针的浓度可为100μM；所述质控区包被有链霉亲和素或生物素的质控探针在反应膜上按照如下步骤得到：链霉亲和素或生物素与质控探针在反应膜上室温反应1~2小时。5.根据权利要求1或4所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爱亮，王之莹，李婷婷，
申请(专利权)人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11