猕猴ABO血型基因分型方法技术

本发明专利技术公开了一种猕猴ABO血型基因分型方法的引物组，包括引物1，引物2，引物3，引物4，引物5，引物6，引物7，引物8。所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5，所述引物6的核苷酸序列为序列6，所述引物7的核苷酸序列为序列7，所述引物8的核苷酸序列为序列8。本发明专利技术还公开了猕猴ABO血型的基因分型方法，本发明专利技术的ABO分型技术，是在分子基因水平上的一种快速，可靠，敏感、低成本的检测方法。

ABO genotyping in rhesus monkeys

【技术实现步骤摘要】
猕猴ABO血型基因分型方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及猕猴ABO血型基因分型方法。
技术介绍
由于猕猴(Macacamulatta，Macaques)与人类拥有共同祖先，他们的基因相似率大于93％，且在神经学、生理学、代谢类疾病及对微生物的敏感性方面表现的都非常相似，所以猕猴作为非人灵长类实验动物模型，被广泛用于生物医药研究中。近几年，生物医药研究领域的投入不断加大，干细胞和移植研究也得到飞速发展，而对用于这方面研究的供体和受体动物的血型要准确的掌握，ABO血型是最重要的血型系统，所以当猕猴被用于研究时就需要明确知道它的ABO血型，才能防止在移植中出现严重的排斥反应，导致实验的失败及资源的浪费。目前应用于人ABO血型鉴定的常规技术仍是基于抗原抗体反应的血凝实验和微柱凝胶实验，但用于人血型检测的商业试剂并不适用于猕猴的血型鉴定。随着测序技术的发展，ABO血型相关的糖基转移酶基因序列都已确定，使血型研究进入分子生物学时代。事实上血型差异主要是与基因突变有关，ABO血型基因上存在丰富的单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)位点，通过分子生物学方法检测ABO血型基因的SNP位点，可以确定A，B或AB表型。目前检测SNP的方法很多，主要有TaqmanPCR、普通PCR结合Sanger测序的方法、下一代测序(NextGenerationSequencing,NGS)技术等。国际上已有多篇报导，用多重普通PCR方法或实时定量PCR进行实验猴的ABO血型分析。竞争性等位基因特异性PCR(KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP)是在等位基因特异性PCR(AlleleSpecificPCR，AS-PCR)基础上，在PCR试剂中加入通用的荧光探针，通过引物3’末端碱基与SNP位点上的碱基特异互补，然后通过直接识别荧光信号来对SNP分型以及检测序列的插入和缺失，目前该技术在植物育种方面应用较多，本文首次将KASP方法应用于实验猴ABO血型检测，所选的2个SNP位点，是猕猴表达A和B转移酶所必需的，第一个SNP位点是检测A或B表型基因区域内负责编码第266位氨基酸的突变；第二个SNP位点是检测第268位氨基酸的突变。目前尚无文献报道用KASP方法进行实验猕猴ABO血型检测。本文建立的KASP方法相较于普通PCR方法，节省了大量的时间；相较于Taqman探针法，节约了合成探针的费用；本文同时还建立了普通PCR结合Sanger测序法用于血型检测，适合没有实时定量PCR仪的实验室开展ABO血型分析。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鉴定猕猴ABO血型方法的引物组及方法。本专利技术的第一方面提供一种鉴定猕猴ABO血型的引物组，包括引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。本专利技术的一优选技术方案中，所述组合物还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。本专利技术的一优选技术方案中，引物1∶引物2∶引物3的摩尔比为4∶4∶5；引物4∶引物5∶引物6的摩尔比为4∶4∶5。本专利技术的一优选技术方案中，所述引物1和引物2的5’端为可识别通用荧光探针的片段；具体而言，引物1的识别片段为“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”；引物2的识别片段为“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”；所述引物4和引物5的5’端为可识别通用荧光探针的序列；具体而言，引物4的识别片段为“GAAGGTGACCAAGTTCATGCT”；引物5的识别片段为“GAAGGTCGGAGTCAACGGATT”。本专利技术的一优选技术方案中，所述荧光基团选自FAM荧光基团和HEX荧光基团。本专利技术第二方面提供鉴定猕猴ABO血型的PCR试剂，包括上述的引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。优选地，还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。本专利技术第三方面提供鉴定猕猴ABO血型的方法，包括如下步骤：(1)提取待测猕猴的DNA，(2)利用前述的引物进行PCR扩增，(3)分析扩增结果，判断待测猕猴的血型。本专利技术的一优选技术方案中，还包括利用引物7，引物8进行PCR测序检测的步骤。附图说明下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：图1为实施例2的KASP法鉴定ABO血型分区结果图；图2为A型、B型、AB型样本普通PCR后测序比对图。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本专利技术。但是本专利技术能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本专利技术内涵的情况下做类似改进，因此本专利技术不受下面公开的具体实施例的限制。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。以下结合附图描述本专利技术具体实施方式。一.材料和方法1.样本15份已确定ABO血型的实验猕猴核酸样本由美国VRL实验室提供，干冰运输至本公司，-20℃存放；实验猴外周血样本(EDTAK2抗凝)，分别来自于广州、广西、四川、海南4个实验猴饲养场，共计51份样本，其中食蟹猴全血38份，恒河猴全血13份，样本冷藏快递运输至本公司，4度存放。2试剂与仪器血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，DP318)，KASP试剂(LGC，KBS-1016-001)，rTaqDNA聚合酶(5U/μL)(Takara,R001WZ)，dNTPMix(2.5mM)(Takara,4030)，琼脂糖(天根生化，RT101)，GelRed(博美达，41003-0.5ml)，特异引物用Primer3软件设计，由苏州泓迅生物科技股份有限公司合成。产物测序由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。荧光定量PCR仪(Bio-Rad，CFX96)，普通PCR仪(杭州博日科技有限公司，TC-96/G/H(b)A)，紫外分光光度计(GE,Nanovueplu)，紫外凝胶成像系统(上海勤翔，Genosens1560)。二.实施例实施例1ABO血型鉴定引物的设计SNP位点的选取及引物设计15号染色体的7号外显子的氨基酸序列中，由于碱基的突变，A抗原第266位氨基酸为亮氨酸和第268位为甘氨酸，而B抗原第266位为甲硫氨酸和第268位为丙氨酸。用Primer3软件设计2组引物组，特异性识别这2个位点上的碱基。另在这2个SNP位点的外围设计1对引物，用于用于Sanger测序验证。引物序列见表1。表1ABO血型鉴定引物实施例21.DNA提取每个动物取500μl抗凝全血，参照血液基因组DNA提取试剂盒说明书提取核酸，用紫外分光光度计测定核酸浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，包括引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。

【技术特征摘要】
1.一种猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，包括引物1，引物2，引物4，引物5，所述引物1的核苷酸序列为序列1，所述引物2的核苷酸序列为序列2，所述引物4的核苷酸序列为序列4，所述引物5的核苷酸序列为序列5。2.根据权利要求1所述的猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，所述组合物还包括引物3和引物6，所述引物3的核苷酸序列为序列3，所述引物6的核苷酸序列为序列6。3.根据权利要求2所述的猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，引物1∶引物2∶引物3的摩尔比为4∶4∶5；引物4∶引物5∶引物6的摩尔比为4∶4∶5。4.根据权利要求1所述的猕猴ABO血型基因分型的引物组，其特征在于，所述引物1和引物2的5’端为可识别通用荧光探针的片段；所述引物4和引物5的5’端为可识别通用荧光探针的片段。5.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：时长军，杨玲焰，王立鹏，
申请(专利权)人：苏州西山生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32