一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库及其应用，所述基因组合包含ACD、CSF3R、CTC1、DKC1、ELANE、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、RBM8A、RPL11、RPL15、RPL17、RPL19、RPL26、RPL31、RPL35A和RPL5等。所述构建高通量测序文库的方法包括以下步骤：针对上述基因组合建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库。

A Method for Detecting Gene Combination, Primer Library and Constructing High Throughput Sequencing Library of Myeloid Failure Syndrome and Its Application

The invention discloses a gene combination, primer library, construction of high-throughput sequencing library and its application for detecting bone marrow failure syndrome, which comprises ACD, CSF3R, CTC1, DKC1, ELANE, FANCA, FANCB, FANCC, FANCD1, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL, FANCM, FANCN, FANCO, RBM8A, RPL11, RPL15, RPL17, RPL19, RPL26. RPL31, RPL35A and RPL5, etc. The method for constructing a high throughput sequencing library includes the following steps: establishing a primer library for the above genome combination, and constructing the high throughput sequencing library by obtaining target DNA fragments from the primers in the primer library.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用
本专利技术涉及血液病分子诊断学领域，具体涉及一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合、引物库、构建高通量测序文库的方法及其应用。
技术介绍
先天性骨髓衰竭综合征，即遗传性骨髓衰竭综合征(InheritedBoneMarrowFailureSyndrome，IBMFS)是一组由先天性造血干细胞功能衰竭而导致的一系或多系血细胞生成减少或功能障碍的遗传综合征。此类疾病临床表现为新生儿期或儿童期的进行性骨髓衰竭(少数患者也可直至成人期才出现典型的临床表现)、可累及多器官的先天性发育异常，并具有向生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征、和急性髓系白血病等疾病转化的倾向。先天性骨髓衰竭综合征患者临床表现具有高度异质性，这与其发病因素的多样性密切相关。研究表明，先天性骨髓衰竭综合征为单基因遗传病，至今已发现数十种相关的致病突变基因。根据受累基因以及发病机制的不同，可将先天性骨髓衰竭综合征分为范可尼贫血、遗传性角化不良、Shwachman-Diamond综合征、Diamond-Blackfan贫血、先天性无巨核细胞性血小板减少症、血小板减少伴桡骨缺失综合征和重型先天性中性粒细胞减少等亚型。然而，不仅不同亚型间临床表型相互重叠，而且还容易与其他疾病相混淆。此外，不同亚型的先天性骨髓衰竭综合征对应的治疗策略与临床预后也不尽相同。因此，明确骨髓衰竭综合征的基因型，对于该疾病的诊断、分型、治疗决策以及预后评估均具有重要意义。近年来，精准医疗的理念已普及至各大医院及科研机构，基于分子生物学层面对先天性骨髓衰竭综合征进行诊断与分型已显得极其重要。传统的Sanger法测序检测存在检测位点有限、多位点检测工艺繁杂等问题。而最新的基于高通量测序法进行的基因检测，良好地弥补了传统检测方法的相关缺点，已逐渐成为市面上遗传病基因检测的主流方法。然而，现有技术中尚未有能够辅助实现骨髓衰竭综合征进行精准分型、治疗指导的基因组合、高通量测序文库及其构建方法的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种能够辅助实现骨髓衰竭综合征进行精准分型、治疗指导的基因组合、引物库、高通量测序文库及其构建方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合，所述基因组合包含ACD、CSF3R、CTC1、DKC1、ELANE、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV、FANCW、G6PC3、GATA1、GATA2、GFI1、HAX1、JAGN1、MPL、NHP2、NOP10、PARN、RBM8A、RPL11、RPL15、RPL17、RPL19、RPL26、RPL31、RPL35A、RPL5、RPS10、RPS17、RPS19、RPS20、RPS24、RPS26、RPS28、RPS29、RPS7、RTEL1、RUNX1、SBDS、TCIRG1、TERC、TERT、TINF2、VPS45、WAS和WRAP53。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案建立了一套骨髓衰竭综合征的基因组合(panel)，本专利技术的基因panel共计65个基因，包含了BMFS所有亚型相关基因，可以协助对骨髓衰竭综合征进行精准分型，并在一定程度上提示临床疾病预后情况。本专利技术方案的基因panel可以对骨髓衰竭综合征进行全面检测，其检测范围包括了骨髓衰竭综合征对应WHO下属所有与基因突变相关的亚型的相关基因位点，具备非常强的临床指导意义。本专利技术还包括上述基因组合在构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库中的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术方案的基因组合实用性强，本专利技术涉及的65个基团，包括了目前国际上所有研究相关的骨髓衰竭综合征基因以及专利技术人通过临床数据分析得到的与骨髓衰竭综合征相关的基因，涉及到了疾病的分型以及治疗，其具有极强的临床意义以及科学研究意义。本专利技术还包括针对上述基因组合的由多对引物对组成的引物库，所述引物库中的引物能够特异性扩增上述基因组合中各基因的外显子区域或热点区域。进一步地，所述引物库包含如下表1所示的895对引物：表1。本专利技术的有益效果在于：所述引物库中的引物经过了大量筛选和实验验证，每对引物对应的产物长度均在100～160bp之间，且保证了各个引物的扩增效率及特异性。使用引物库中的引物对基因panel扩增的效率均一性能达到85％以上，扩增效率、扩增均一性、非特异性扩增比例等等各方面性能均经过详细评估及优化，保证了测序数据的高利用率，确保了结果的稳定性。本专利技术还包括一种构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：利用上述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库(Library)。进一步地，所述高通量测序文库是通过以人基因组DNA为模板，使用上述引物库进行多重PCR扩增得到的。进一步地，所述构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：S1、从外周血样本中，提取血液DNA样本；S2、以上述操作提取的DNA为模板、以所述引物库中引物进行多重聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)反应，得到含有目标DNA片段集合的混合液。其中，多重聚合酶链式反应(多重PCR)的原理如图1所示。S3、向所述步骤S2得到的含有目标DNA片段的混合液中，添加不同的高通量测序(又称二代测序，NextGenerationSequencing，NGS)标签(index)，然后两端连接含有测序所需的接头，并利用磁珠进行纯化，最终得到带测序接头的目标DNA片段混合体，即高通测量序文库(Library)。本专利技术的有益效果在于：本专利技术的65个基因涉及895个扩增片段，采用多重PCR的方法进行NGS文库构建，在降低了起始DNA量的前提下，提供了一种快捷的建库技术(整个过程仅需7个小时)。本专利技术方案采用低起始量的同时能检测广泛位点：采用多重PCR法构建文库，其优点在于，相比于传统的Taqman-qPCR法检测突变，多重PCR法能一次性检测几百、上千个片段及相关位点，具有传统PCR及微滴度PCR(dropletdigitalPCR，ddPCR)无法达到的通量。多重PCR法构建DNA文库，仅需要最低1ng的DNA起始量，与杂交捕获法构建NGSDNA文库相比，该方法大大降低了DNA的量的需求。在进行现有的SNV、indel检测中该方法尤其适用。进一步地，所述步骤S1中采用商用的DNA提取试剂盒；优选地，所述DNA提取试剂盒购自Qiagen；更优选地，采用Qiagen生产的DNA提取试剂盒结合Nanodrop、Qubit等仪器进行提取后DNA浓度及质量监控。进一步地，所述步骤S2中，所述PCR试剂为商业购买的试剂；优选地，所述PCR试剂购自Lifetech公司；更优选地，所述PCR试剂的型号为AmpliseqLibrarykit。优选地，所述步骤S3中，所述index采用Illumina通用index序列，且最终文库结构为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合，其特征在于：所述基因组合包含ACD、CSF3R、CTC1、DKC1、ELANE、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV、FANCW、G6PC3、GATA1、GATA2、GFI1、HAX1、JAGN1、MPL、NHP2、NOP10、PARN、RBM8A、RPL11、RPL15、RPL17、RPL19、RPL26、RPL31、RPL35A、RPL5、RPS10、RPS17、RPS19、RPS20、RPS24、RPS26、RPS28、RPS29、RPS7、RTEL1、RUNX1、SBDS、TCIRG1、TERC、TERT、TINF2、VPS45、WAS和WRAP53。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测骨髓衰竭综合征的基因组合，其特征在于：所述基因组合包含ACD、CSF3R、CTC1、DKC1、ELANE、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV、FANCW、G6PC3、GATA1、GATA2、GFI1、HAX1、JAGN1、MPL、NHP2、NOP10、PARN、RBM8A、RPL11、RPL15、RPL17、RPL19、RPL26、RPL31、RPL35A、RPL5、RPS10、RPS17、RPS19、RPS20、RPS24、RPS26、RPS28、RPS29、RPS7、RTEL1、RUNX1、SBDS、TCIRG1、TERC、TERT、TINF2、VPS45、WAS和WRAP53。2.一种如权利要求1所述的基因组合在构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库中的应用。3.一种针对如权利要求1所述的基因组合设计的由多对引物对组成的引物库，其特征在于：所述引物库中的引物能够特异性扩增所述基因组合中各基因的外显子区域或热点区域。4.根据权利要求3所述的引物库，其特征在于：所述引物库包含如下表1所示的895对引物：表1。5.一种构建检测骨髓衰竭综合征的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：利用如权利要求3所述的引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑峰，肖敏，张炜，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44