一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用，包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，一种用于构建上述的基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的试剂盒，包含至少一种引物，所述引物选自所述引物库。将上述试剂盒用于淋巴瘤基因的高通量测序方法，包括以下步骤：利用所述试剂盒中的引物构建测序文库后，针对测序文库进行测序分析；其中，所述测序分析的具体操作为：将提取的各个目标DNA片段的核苷酸序列进行读取并记录，生成数据文件，并对所述数据文件进行分析处理。与现有技术相比，本发明专利技术方案在高通量测序过程中具有低起始量、检测广泛、灵敏度高、准确性高、适用范围广、实用性强等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用
本专利技术涉及分子生物学
，具体涉及一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用。
技术介绍
淋巴瘤(lymphoma)是一类起源于淋巴结或其他淋巴组织的恶性肿瘤，分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkinlymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinlymphoma，NHL)两大类，根据2016年版世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)定义的淋巴瘤亚型超过40种，每一种淋巴瘤都有独特的分子遗传学背景，并可对应不同的治疗方案及预后分层，即使为同一亚型，其治疗方案也不尽相同。因此，相对于其它实体瘤而言，淋巴瘤的诊断和治疗更为复杂。淋巴瘤的精确诊断需要依赖形态病理学(Morphology)、免疫表型(Immunology)、细胞遗传学(Cytogenetics)和分子遗传学(Moleculargenetics)等技术综合判断；而其中，分子遗传学尤为重要。目前传统的检测方法，均基于聚合酶链式反应法(PolymeraseChainReaction，PCR)所衍生的技术，如荧光探针定量法(Taqman-RealTime-PCR，Taqman探针法)、桑格毛细管电泳法(Sanger法)等等方法，虽然能在一定程度上辅助临床对淋巴瘤进行分型及预后判断，但存在着一次性检测位点少、不能涵盖所有检测位点的缺陷，同时，Sanger法检测单核苷酸碱基突变(Singlenucleotidevariants，SNV)、微小插入/缺失突变(Insertion-deletion，Indel)等突变类型还存在着检测灵敏度差等问题(灵敏度约10％-20％)。而近年来兴起的数字聚合酶链式反应法(DigitalPolymeraseChainReaction，DDPCR)，虽然有极高的检测灵敏度(0.01％)，但同样不能一次性检测大量的基因位点。这些方法均不能很好的满足临床上对淋巴瘤这类亚型种类繁多、所涉大量基因突变位点的疾病的诊疗需求。高通量测序，又称二代测序(NextGenerationSequencing，NGS)，其以单次检测通量高、覆盖面广、检测灵敏度高等优点迅速被各大科研和临床机构所采用。目前随着该系列平台配套技术的完善及成熟，各大公司及医院已经开展包括遗传病、癌症、生育健康、胚胎移植前遗传学筛查诊断(PreimplantationGeneticScreeningandPreimplantationGeneticDiagnosis，PGS/PGD)在内的多种检测服务。此外，随着国家对高通量测序监管的加强，高通量测序室间质量评价、高通量测序实验室建设规范等质量监管系统也日渐完善。因此，高通量测序应用于临床的意义不言而喻。目前，NGS在淋巴瘤中的应用主要可概括为以下三个方面：1.诊断分型:不同亚型的淋巴瘤有着不同的分子突变图谱，基因突变对于淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有着重要意义。例如：1)有MYD88L265P突变的DLBCL多为ABC亚型，MYD88其他位点突变在ABC和GCB型中分布无差异；2)原发中枢神经系统的大B细胞淋巴瘤中，最常见的突变为MYD88和CD79B突变MYD88和CD79B突变比例高于50％，突变热点分别为MYD88L265P和CD79BY196突变，MYD88/CD79B突变在继发性中枢淋巴瘤中少见，可作为鉴别指标；3)Burkitt淋巴瘤常有MYC的重排、体细胞高频突变及ID3的功能失活性突变；4)BRAFV600E突变几乎见于所有HCL。2.靶向治疗：NGS发现的基因突变异常为靶向药的使用提供依据。例如：1)CREBBP/EP300突变在DLBCL和FL中常见，CFDA在2014年批准HADC抑制剂西达本胺的上市；2)EZH2Y641突变见于22％的GCBDLBCL和7.2％的FL，EZH2Y641突变使其三甲基化活性增强，单甲基化活性减弱，为功能获得性突变EZH2抑制剂tazemetostat在伴EZH2突变的复发难治性B细胞淋巴瘤的Ⅱ期临床试验正在开展；3)根据NGS结果，BTK抑制剂伊布替尼，BCL-2抑制剂ABT199等的相继上市等等。3.预后评估：不同淋巴瘤亚型的遗传学特点提示不同的预后。例如：1)MYD88L265P是DLBCL独立不良预后因素；2)TP53突变是多种淋巴瘤的不良预后因素；3)DDX3X突变提示NK/T细胞淋巴瘤预后不良。然而，目前在诊疗淋巴瘤方面，传统的分子生物学方法主要有毛细管电泳、Taqman探针法，而近年来兴起的还有数字PCR法，这些方法均有诸多限制和缺陷。而目前各大医院及公司虽有一些相关的NGS检测试剂盒，但是普遍存在试剂盒检测范围涵盖面不够、检测结果解读不清晰、对临床提示不详尽等缺陷。导致目前淋巴瘤突变高通量检测不能有效的普及到各大医院当中。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是：提供一种能够通过高通量测序检测出与淋巴瘤相关的157个基因2300个位点，从而为淋巴瘤的疾病诊断、分型、治疗、预后监控进行全面展示，进而为临床诊疗提供有效的临床指导的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法及其应用。为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、R本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SETD2、SF3B1、SGK1、SH2B3、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STAT3、STAT5B、STAT6、TBL1XR1、TCF3、TET1、TET2、TMSB4X、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF1B、TP53、TRAF3、TRRAP、U2AF1、USP7、VAV1、VMA21、WHSC1、WT1和XPO1。...

【技术特征摘要】
1.一种构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：包括以下步骤：针对目的基因建立引物库，利用所述引物库中的引物获取目标DNA片段构建形成所述高通量测序文库，其中，所述目的基因包括ABL1、ACTG1、AKT1、ARID1A、ATM、ATP6AP1、ATP6V1B2、B2M、BCL10、BCL11B、BCL2、BCL6、BCOR、BIRC3、BRAF、BTG1、BTG2、BTK、CARD11、CASP10、CCND1、CCND3、CCR4、CCR7、CD28、CD58、CD70、CD79A、CD79B、CD83、CDKN1B、CDKN2A、CHD2、CNOT3、CREBBP、CRLF2、CTNNB1、CXCR4、DDX3X、DIS3、DNM2、DNMT3A、DTX1、DUSP2、EBF1、EED、EGR1、EGR2、EIF2A、EP300、ETV6、EZH2、FAM46C、FAS、FAT1、FBXW7、FGFR3、FLT3、FOXO1、FYN、GATA3、GNA13、GNAQ、GPR183、HIF1A、HIST1H1B、HIST1H1C、HIST1H1D、HIST1H1E、HNRNPA2B1、HRAS、HVCN1、ID3、IDH1、IDH2、IGLL5、IKBKB、IKZF1、IKZF3、IL7R、IRF4、ITPKB、JAK1、JAK2、JAK3、KDM6A、KIT、KLF2、KLHL6、KMT2C、KMT2D、KRAS、LTB、MAP2K1、MAP3K14、MAPK1、MAX、MED12、MEF2B、MYC、MYD88、NF1、NFE2、NFKBIE、NOTCH1、NOTCH2、NRAS、NT5C2、PAX5、PHF6、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLCG1、PLCG2、POT1、POU2AF1、POU2F2、PRDM1、PRKCB、PTEN、PTPN1、PTPN11、RB1、RHOA、RPL10、RPS15、RRAGC、SAMHD1、SETD2、SF3B1、SGK1、SH2B3、SMARCA4、SMARCB1、SOCS1、STAT3、STAT5B、STAT6、TBL1XR1、TCF3、TET1、TET2、TMSB4X、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF1B、TP53、TRAF3、TRRAP、U2AF1、USP7、VAV1、VMA21、WHSC1、WT1和XPO1。2.根据权利要求1所述的构建基于淋巴瘤基因检测的高通量测序文库的方法，其特征在于：所述引物库是选取所述目的基因的外显子区域或热点区域，进行多重PCR引物设计，根据设计好的引物进行引物合...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑峰，何旭华，肖敏，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44