髓系肿瘤的高通量测序检测制造技术

本发明专利技术提供包含80个髓系肿瘤相关基因的Panel、针对此Panel设计的引物组合，以及它们在高通量测序检测髓系肿瘤中的应用。本发明专利技术可以检测包括AML、MDS、MPN等等髓系肿瘤在内所有的髓系肿瘤相关基因突变，并通过该检测对髓系肿瘤进行精准诊断分型、靶向治疗、预后分层及耐药监测等，为全面、准确获取髓系肿瘤患者分子遗传学背景提供有力的帮助。

Detection of myeloid tumors by high throughput sequencing

【技术实现步骤摘要】
髓系肿瘤的高通量测序检测
本专利技术属于血液病分子诊断学领域，具体涉及髓系肿瘤的高通量测序检测。
技术介绍
髓系肿瘤是一类起源于造血干/祖细胞克隆性造血系统的疾病，按照世界卫生组织(WorldHealthOrganization，WHO)最新的分类，髓系肿瘤包括了急性髓系白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)、骨髓增生性肿瘤(Myeloproliferativeneoplasms，MPN)、骨髓增生异常综合征(Myelodysplasticsyndromes，MDS)、MPN伴MDS、髓系/淋系肿瘤伴嗜酸性粒细胞增多和PDGFRα、PDGFRβ、FGFR1异常或伴PCM1-JAK2基因融合等等多种类型。各类型中又可分为多种亚型，大部分亚型与基因突变有关。如MPN下的亚型中，慢性粒细胞白血病(Chronicmyeloidleukemia，CML)被定义为具有费城染色体(Ph染色体)的一类疾病，即该亚型均具有BCR-ABL1融合基因；而真性红细胞增多症(PV)、原发性血小板增多症(ET)和原发性骨髓纤维化(PMF)则具有共同的热点突变——JAK2基因的V617F突变这一特征。除了大部分亚型具有其基因突变特点以外，一些亚型由于具有明确的预后或者用药相关的基因突变也被WHO划分出来，如髓系/淋系肿瘤伴嗜酸性粒细胞增多和PDGFRα、PDGFRβ、FGFR1异常或伴PCM1-JAK2融合基因这一分类中，PDGFRα、PDGFRβ均与酪氨酸激酶抑制剂直接相关，而FGFR1突变则涉及到预后不良、PCM1-JAK2融合基因对JAK2抑制剂敏感等等。进一步的，在AML分型中，类似RUNX1-RUNX1T1、CBFβ-MYH11、PML-RARα均被WHO单独划分为一类亚型。整体而言，髓系肿瘤分型复杂，其分型既涉及到了形态学，又涉及到了免疫及分子等层面，而近年来，特别是分子学层面的分型被逐步提升到相当重要的一个地位。2016年WHO分型指南中，参考的是目前主流的MICM分型方法，MICM分型法包括了形态病理学(Morphology)、免疫表型(Immunology)、细胞遗传学(Cytogenetics)、分子遗传学(Moleculargenetics)4个层面，并且近年来，WHO分型越来越倾向于分子遗传学层面的分型。而髓系肿瘤以分子学异常种类多样(包括插入/缺失突变、点突变及融合基因等等)、突变涉及面广泛(包括疾病的分型、预后及用药等等)导致其检测及靶向治疗较一般癌种更为精细。髓系肿瘤经典的分子学异常包括了BCR-ABL1、PDGFRα/β、RUNX1-RUNX1T1、CBFβ-MYH11、MLLT3-KMT2A等融合基因以及FLT3、C-KIT、NPM1、JAK2、CEBPA、NOTCH1、KMT2A、ABL1、TP53、MPL、CALR等等基因突变。这些分子遗传学异常一部分决定了髓系肿瘤的分型，如MPN中如发现BCR-ABL1融合基因突变则可分型为慢性粒细胞白血病这一亚型；而在40％的慢性粒单核细胞白血病(Chronicmyelomonocyticleukemia，CMML)中可发现有ASXL1突变，46％CMML可发现有SRSF2基因突变等等。进一步在用药方面，根据不同分子学异常，对于髓系肿瘤有一系列靶向药物可以选择，包括伊马替尼、芦可替尼、利妥昔单抗等等，其在使用这些靶药前，需要对患者进行基因检测从而进行基因异常类型鉴定，达到靶向治疗这一目的。在我国髓系肿瘤中，仅白血病发病率就约有2.76/10万人，而其中90％左右发生在成人中，同时在儿童中也是最常见的恶性肿瘤之一。在欧美等发达国家中，髓系肿瘤的5年生存率已经达到80％以上，而国内患者的平均5年生存率明显低于欧美，提示我国在髓系肿瘤治疗方面与发达国家相比仍有一定的差距。髓系疾病的诊疗发展到现在，已经被分为诸多亚型，并涉及到了的庞大基因网络，其基因突变也涵盖了几乎所有的突变种类。这也导致了血液病的精准医疗需要更为全面而精细的检测手段来辅助临床诊疗的开展。当前，由于方法的局限性，融合基因的检测大多数还停留在RNA水平。只有少数断点位置固定的融合基因可以基于DNA进行准确的检测。而传统的点突变及插入、缺失突变，则可以通过多种分子学检测方法进行检测，如聚合酶链式反应法(PolymeraseChainReaction，PCR)所衍生的技术，如荧光探针定量法(Taqman-RealTime-PCR法)、桑格毛细管电泳法(Sanger法)等等方法。这些方法目前广泛应用在各大机构当中，并已经非常成熟。但随着基因突变检验需求的日益增加以及检测位点的日益增多，目前的方法已经不能很好的满足各大科研机构以及临床机构的需求。所以基于二代测序的技术在近年来被迅速应用到血液疾病乃至各大肿瘤的检测应用当中。二代测序准确率可以达到99.9％，相比传统的一代测序以及定量PCR，该准确率有着数量级的提升，并且通过最新的分子标签(moleculerbarcode)技术，二代测序的检测下限可以达到0.1％。基于二代测序技术，目前已经有一些血液病相关的技术及产品，但由于血液肿瘤领域研究进展快，相关基因及位点更新也较快，导致目前主要相关产品及服务涉及到下述2个问题：(1)整体检测内容相对滞后，相关检测基因跟不上当前血液肿瘤领域目前的发展速度，并且产品未见更新；(2)检测内容较少，涵盖基因突变位点基本只涉及到分型或者预后当中的一种或几种疾病，临床指导性不强。这些不仅限制了临床相关血液肿瘤诊疗的发展，还限制了二代测序技术在血液科疾病临床应用的普及。亟待髓系综合大检测基因基因的组合及引物(以下简称panel)出现。
技术实现思路
本专利技术的一方面提供髓系肿瘤相关基因组合在构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包含表1所示的全部80个基因。表180个基因及转录本列表在一些实施方案中，所述基因组合用于制备能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合，所述能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合用于构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库。因此，本专利技术的另一方面提供能够特异性检测所述基因组合的引物组合或探针组合在构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库中的应用。在一些实施方案中，所述引物组合包括表2所示的全部引物(即SEQIDNO:1-SEQIDNO:1786)。表2893对引物序列本专利技术的另一方面提供引物组合，所述引物组合包括表2所示的全部引物(即SEQIDNO:1-SEQIDNO:1786)。本专利技术的另一方面提供构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：(1)以目标DNA为模板，使用能够特异性检测表1所示全部基因组合的引物组合进行多重PCR反应；(2)向步骤(1)的反应产物添加NGS测本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.髓系肿瘤相关基因组合在构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括下表所示的基因：/n

【技术特征摘要】
1.髓系肿瘤相关基因组合在构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括下表所示的基因：





2.能特异性检测髓系肿瘤相关基因组合的引物组合或探针组合在构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库中的应用，所述基因组合包括下表所示的基因：








3.根据权利要求2的应用，其中所述引物组合包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:1786所示的引物。


4.用于检测髓系肿瘤的引物组合，其中所述引物组合包括SEQIDNO:1-SEQIDNO:1786所示的引物。


5.构建检测髓系肿瘤的高通量测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)以目标DNA为模板，使用能够特异性检测髓系肿瘤相关基因组合的引物组合进行多重PCR反应，所述基因组合包括下表所示的基因：






(2)向步骤(1)的反应产物添加NGS测序标签，并在两端连接测序所需的接头，获得带测序接头的目标DNA片段混合物，即高通量测序文库。


6.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：周剑峰，何旭华，肖敏，张炜，朱洲杰，
申请(专利权)人：珠海铂华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44