用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用，属于肿瘤生物治疗技术领域。本发明专利技术首次通过试验证实SEQ ID NO:1所示miRNA序列与长春新碱的耐药性相关，miRNA在长春新碱耐药细胞中高表达、敏感细胞中低表达，因此可以作为肿瘤细胞长春新碱耐药的标志物。根据该标志物设计的引物、试剂盒及检测方法可用于临床判断肿瘤细胞对长春新碱的耐药性，进一步指导临床用药并实现精准治疗，提高疗效，降低副作用。本发明专利技术为设计肿瘤细胞长春新碱耐药药物提供了新的靶点，可用于直接开发拮抗肿瘤细胞长春新碱耐药性的药物。

Primers, kits, methods and applications for detecting miRNA expression related to vincristine resistance in colorectal cancer

【技术实现步骤摘要】
用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用本申请为下述申请的分案申请，原申请的申请日：2017年03月06日，原申请的申请号：201710129192.X，原申请的专利技术名称：用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物、试剂盒、方法及应用。
本专利技术涉及一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，同时还涉及包含该引物的试剂盒和检测方法，以及该miRNA在制备拮抗肿瘤耐长春新碱的药物中的应用，属于肿瘤生物治疗

技术介绍
恶性肿瘤是严重威胁人类健康的常见病及多发病，而结直肠癌(colorectalcancer，CRC)是消化系统常见的恶性肿瘤之一，在发达国家高居癌症发病率第1位、死亡率第2位，高居我国癌症死亡率第4位，同时其发病年龄趋向老龄化。近年的流行病学资料显示，全世界CRC新发病例数占全部恶性肿瘤新发病例数的9.4％。随着经济的发展、生活水平的提高和生活方式的改变，CRC的发病率还将呈不断上升的趋势。目前CRC的治疗是以手术为主，辅以放、化疗治疗，其中药物治疗包括化学药物治疗和靶向药物治疗。但是，由于肿瘤细胞群体具有内在的、高度有序发展的抗药能力，无论是细胞毒类药物还是靶向药物，均未能克服耐药问题。肿瘤细胞一旦产生耐药性，化疗药物就不能发挥完全的抗癌作用杀死癌细胞，即使大多数的肿瘤被杀死，而这一小部分具有抗药性的癌细胞依然会继续生长，造成癌症复发。因此肿瘤的耐药性是影响化疗疗效和肿瘤根治的主要原因，肿瘤耐药是肿瘤治疗急需解决的关键问题之一。微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约22个核苷酸(nucleotide，nt)的单链小RNA分子，其中21nt～23nt长度的miRNA占大多数，约为84％，属于非编码RNA(non-protein-codingRNAs，ncRNAs)的一种。miRNA通过在转录后调控基因表达水平而参与调控生命活动，包括细胞增殖、凋亡、脂肪代谢、神经元发育、激素分泌、肿瘤血管生成、干细胞分化、肿瘤细胞浸润及转移等多种生理和病理过程。最近的研究表明，miRNA对多基因表达的调控具有高效性和特异性，对靶基因的异常调控可能构成肿瘤耐药机制，是肿瘤耐药复杂性调控的重要构成部分。近些年来，microRNAs不仅参与肿瘤的发生和发展，而且在化疗多药耐药性的不同机制和信号通路中也发挥了至关重要的作用。它们可能成为逆转肿瘤化疗药物耐药性、改善化学治疗效果、提高患者生存率的一种有效基因治疗策略。长春新碱(vincristine，VCR)是一种长春花生物碱，被广泛用于急性白血病和实体瘤的治疗。但是在使用过程中肿瘤细胞会逐渐产生对VCR的耐药性。研究表明，miRNA与肿瘤细胞的耐药性密切相关，在MCF-7/VP-16乳腺癌耐药细胞中miR-326表达下降，而在多药耐药(包括依托泊苷、顺铂、阿霉素等)的小细胞肺癌中miR-134表达下降。寻找耐药相关的miRNA作为长春新碱耐药性诊断的标志物，并通过将miRNA模拟物或抑制剂与长春新碱联合用药来逆转肿瘤细胞的耐药性，对肿瘤的个性化诊断和治疗具有非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物。其次，本专利技术提供一种包含上述引物的试剂盒。次之，本专利技术提供一种用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法。再次，本专利技术提供一种上述引物、试剂盒在判断肿瘤细胞对长春新碱耐药性或者筛选拮抗肿瘤细胞对长春新碱耐药性药物中的应用。最后，本专利技术提供一种miRNA在制备拮抗肿瘤细胞耐药性药物中的应用。同时，本专利技术提供一种用于治疗结直肠癌的药物组合物。为了实现以上目的，本专利技术所采用的技术方案是：用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的引物，根据该miRNA序列(如SEQIDNO:1所示)设计合成，包括逆转录引物和荧光定量PCR引物。所述逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示。所述荧光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的试剂盒，除包含上述引物外，还可以包含通用的miRNA逆转录试剂和荧光定量聚合酶链反应试剂。所述miRNA逆转录试剂包括逆转录酶、dNTPmix、buffer缓冲液等。所述荧光定量聚合酶链反应试剂包括荧光染料、TaqDNA聚合酶、dNTPmix和buffer缓冲液等。所述试剂盒还可以包含DNA消化试剂以及内参的逆转录引物和荧光定量PCR引物。所述DNA消化试剂包括DNaseI(RNase-free)、EDPC等。所述内参可采用U6snRNA管家基因，内参的逆转录引物如SEQIDNO:8所示，荧光定量PCR的正、反向引物分别如SEQIDNO:9、10所示。用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法，包括以下步骤：1)以结直肠癌细胞的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；2)以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miRNA的表达量；步骤1)中逆转录的引物包括miRNA的逆转录引物和内参的逆转录引物；步骤2)中荧光定量PCR扩增的引物包括miRNA的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物；miRNA的序列如SEQIDNO:1所示。步骤1)中逆转录的反应体系为：5×RTbuffer(250mMTris-HCl(pH8.3)、375mMKCl、15mMMgCl2、50mMDTT)4μL，200U/μL逆转录酶1μL，10μMmiRNA的逆转录引物0.5μL，dNTP(2.5mMeach)2.5μL，10μM内参的逆转录引物0.5μL，1.0μg/μLRNA1μL，无RNA酶水补足至20μL。步骤1)中逆转录的反应条件为：16℃30min，42℃30min，85℃灭活逆转录酶5min。反应结束后将产物放在冰上待用或-20℃保存。步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应体系为：dNTP(2.5mMeach)2.5μL，2×SYBRGreenPCRMasterMix(购自ABI公司)10μL，1.0μg/μLcDNA1μL，10μMmiRNA的荧光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，10μM内参的荧光定量PCR引物(正、反向引物各0.5μL)1μL，双蒸水补足至20μL。步骤2)中荧光定量PCR扩增的反应条件为：95℃变性5min，40个循环(95℃15s，60℃15s，72℃20s，78℃20s，95℃15s)。具体的，步骤1)中miRNA的逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示。步骤2)中miRNA的荧光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。步骤2)中检测miRNA的表达本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n1）以结直肠癌细胞的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；/n2）以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miRNA的表达量；/n步骤1）中逆转录的引物包括miRNA的逆转录引物和内参的逆转录引物；/n步骤2）中荧光定量PCR扩增的引物包括miRNA的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物；/nmiRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测与结直肠癌长春新碱耐药相关的miRNA表达的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）以结直肠癌细胞的总RNA为模板，逆转录得到cDNA；
2）以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增，检测miRNA的表达量；
步骤1）中逆转录的引物包括miRNA的逆转录引物和内参的逆转录引物；
步骤2）中荧光定量PCR扩增的引物包括miRNA的荧光定量PCR引物和内参的荧光定量PCR引物；
miRNA的序列如SEQIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中miRNA的逆转录引物如SEQIDNO:2、3或4所示；步骤2）中miRNA的荧光定量PCR引物的正向引物如SEQIDNO:5或6所示，反向引物如SEQIDNO:7所示。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中检测miRNA的表达量以U6snRNA管家基因作为内参，采用相对定量法。

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【专利技术属性】
技术研发人员：王天云，董卫华，张俊河，高建辉，姚朝阳，倪天军，
申请(专利权)人：新乡医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41