一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及分子生物技术领域，公开了一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。本发明专利技术独特之处在于通过在BRAF基因K601E突变检测引物的3’末端连续设计了2个错配碱基，大大提高了该突变位点检测的特异性，减少了周围临近突变位点对检测的干扰，获得了很好的检测效果。本发明专利技术还公开了一种利用上述引物和探针检测BRAF基因K601E突变的检测试剂盒，能够快速、灵敏、准确地检测BRAF基因K601E突变。本发明专利技术具有特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便等优点，具有良好的临床应用前景。

Primer, probe and kit for detecting k601e mutation of BRAF gene

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒
本专利技术涉及分子生物
，具体地涉及一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。
技术介绍
BRAF基因突变常见于一些恶性肿瘤，例如黑色素瘤、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤和大肠癌等。在甲状腺癌中，BRAF基因突变的频率也很高，其中尤以BRAF基因V600E的突变频率最高，因为该突变常常与临床不良预后相关，因此BRAF基因V600E突变是临床检测的重要靶点。但是，BRAF基因上除了发生V600E突变外，还会发生K601E突变，V600E突变主要和甲状腺乳头状癌（PTC）相关，但K601E突变则是甲状腺滤泡型腺瘤或滤泡型甲状腺乳头状癌（FVPTC）中的特有突变。临床数据证实，和BRAF基因V600E突变不同的是，BRAF基因K601E突变往往是患者预后较好的指标之一。因此，作为一个临床良性预后的分子诊断标识，需要将K601E突变位点与BRAF基因上的其他突变位点，尤其是V600E突变位点区分开来，但目前临床上针对BRAF基因突变的检测，主要还是集中在BRAF基因V600E突变，对于BRAF基因K601E突变的检测方法和检测产品则并不多见。本专利技术主要基于扩增阻滞突变系统PCR（ARMS-PCR）的原理对检测体系进行设计和优化。通过检索NCBI数据库，发现BRAF基因K601E突变位点前后25bp的序列中包含5处连续的相同碱基排列，分别为AAAAA、TTT、AAA、GGG、CCC，突变位点处的序列为AAAT。根据PrimerPremier5.0等设计软件的基本规则，在进行引物探针设计时，要避免同一碱基的重复过多，特别是避免出现连续4个或更多相同碱基，而且在引物的3’端避免为A，避免出现3个及以上连续相同的碱基。同时，在BRAF基因K601E位点附近由于还存在较多其他类型的突变，例如V600E、V600K、V600R等，这些临近位点的突变对BRAF基因K601E突变的检出也造成了很大的干扰。由于存在以上引物探针设计条件的限制，且实验中针对该区域设计的多轮引物探针测试结果显示，根据常规原理设计的引物探针组合特异性差，非特异性扩增明显，无法有效区分BRAF基因野生型和K601E突变型。该位点的引物探针设计需要寻找新的技术方案来解决现有的技术问题。为此，本专利技术将引物3’末端设定为K601E突变位点的互补碱基，随后连续引入了2个错配碱基，由于PCR过程中引物延伸是由3’端开始的，3’端的碱基对引物延伸至关重要，在加入2个错配碱基之后，只有突变型模板可以依靠3’末端的碱基对互补实现稳定的扩增，而野生型模板由于3’端连续3个碱基完全不配对，无法进行有效扩增，从而有效区分了BRAF基因野生型和K601E突变型，同时该方法也可降低检测结果中假阳性的发生率。但具体引入哪两个错配碱基，才能达到最优的检测效果，需要经过对检测反应体系和反应条件的不断优化和调整，最终获得了本专利技术所述的最优的组合方案和PCR反应条件，使BRAF基因K601E突变能被稳定检出，且检出的突变频率的下限稳定在0.5%，优于普通ARMS-PCR的检测方法，满足了临床检测的需求。在探针选择方面，本专利技术采用了特异性好、灵敏度高的TaqmanMGB探针，探针3’端有NFQ-MGB非荧光淬灭基团修饰，该基团本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度,同时该修饰可以将探针的Tm值提高10℃左右，增加了探针的特异性。同时该条探针为突变体系检测和质控体系检测的通用探针，在保证检测特异性和灵敏度的基础上，降低了检测成本。最后需要说明的是，利用本专利技术方法，无需计算ΔCT值，只需通过检测特异性扩增产物的“有”或“无”，即突变检测扩增曲线的“有”或“无”，即可对最终检测结果进行判读，非常简单和直观。总而言之，本专利技术公开了一种操作简便、成本低廉、结果准确和判读方便的用于检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒。本试剂盒以DNA为检测对象，检测样本中是否存在BRAF基因K601E突变，能在60分钟内获得准确的检测结果，且能达到0.5%的突变频率检测下限，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便等优点，具有良好的临床应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简便、成本低廉、结果准确、判读方便的检测BRAF基因K601E突变的引物、探针及试剂盒，满足临床上对于BRAF基因K601E突变的检测需求。本专利技术提供了一种检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其特征在于引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，其中引物序列SEQIDNO.1的3’末端为突变位点互补碱基C,之后是连续2个错配碱基AC，引入2个错配碱基是为了提升突变检测引物的特异性，探针包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团，该基团本身不产生荧光，一方面可以大大降低本底信号的强度，另一方面，当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号，随着PCR的进行，Taq酶在DNA链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5’→3’外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离荧光淬灭基团，产生荧光信号。同时该特异性探针上的MGB修饰基团，可以将该探针的Tm值提高10℃左右，增加探针的特异性。进一步的，还包括质控引物，质控引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。其中，核苷酸序列为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2的引物与核苷酸序列为SEQIDNO.3的探针一起组成突变检测反应体系，核苷酸序列为SEQIDNO.4和SEQIDNO.5的引物与核苷酸序列为SEQIDNO.3的探针组成质控检测反应体系。上述引物及探针可以应用于制备检测BRAF基因K601E突变的试剂盒。所述一种检测BRAF基因K601E突变的试剂盒，其特征在于，包含以下试剂：1）PCR反应液及50×ROX：PCR反应液包含DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dTTP、dCTP、dGTP，50×ROX为含ROX荧光的参比染料；2）突变检测引物探针预混液:核苷酸序列如SEQIDNO.：1、2、3所示的引物和探针的混合液，其中每条引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。两条突变检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合；3）质控检测引物探针预混液:核苷酸序列如SEQIDNO.：3、4、5所示的探针和引物的混合液，其中每条引物的浓度为10μM，探针的浓度为10μM。两条质控检测引物和探针的母液以2：2：1的体积比例混合；4）阳性对照品：含有BRAF基因K601E突变的基因组DNA与BRAF野生型的基因组DNA的混合液，其中，BRAF基因K601E突变频率为5%，样本浓度为10ng/μL；5）阴性对照品：含有BRAF基因野生型的基因组DNA溶液，其中，BRAF基因K601E突变频率为0%，样本浓度为10ng/μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其特征在于，引物包括SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，探针包括SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测BRAF基因K601E突变的引物和探针，其特征在于，引物包括SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，探针包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，且所述探针的5’端修饰有FAM荧光基团，3’端修饰有NFQ-MGB非荧光淬灭基团。


2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于还包括质控引物，质控引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4和SEQIDNO.5所示。


3.一种用于检测BRAF基因K601E突变的试剂盒，其特征在于，含有权利要求1或2所述的引物和探针。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，含有阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有BRAF基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇清，裴婷婷，赵艳伟，
申请(专利权)人：上海润安医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31