一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术领域，具体的，提供了一种可以通过检测组织中hsa‑miR‑146b‑3p表达量的变化，鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，同时还提供了含有该组合物的试剂盒以及所述组合物的用途。使用本发明专利技术的组合物能够以较高的灵敏度和特异性对细胞学无法明确诊断的甲状腺结节进行良恶性鉴别，提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，为国家节约医疗资源，无疑具有非常重大的临床价值和巨大的经济效益。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物、试剂盒及其用途
本专利技术涉及分子生物学
，具体地，涉及鉴别甲状腺结节良恶性的领域，更具体地，涉及组织样本中hsa-miR-146b-3p表达量的检测。
技术介绍
甲状腺结节是甲状腺疾病中最为常见的一种疾病，根据性质可分为良性结节和甲状腺癌，两者的处理方式不同，对患者生存质量的影响和涉及的医疗花费也有显著差异。在我国，甲状腺结节的患病率呈逐年增长的趋势，甲状腺结节患者的人数高达1.5亿，而其中5%-15%的甲状腺结节为甲状腺癌。若能早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。对于甲状腺癌的诊断方法，目前临床所使用的“金标准”是超声引导下的甲状腺细针穿刺活检细胞病理学检查，其检测灵敏度和特异性分别为86%和74%。对那些未能准确判断出结节良恶性的患者，临床医生会比较倾向于选择激进的手术方式进行治疗，但如果后期病理证实被手术切除的结节是良性的，则手术就是不必要的，是一种医疗浪费，而手术所带来的后遗症也会对患者的生活质量产生长期的影响。鉴于此，临床上亟需一种性能稳定可靠、灵敏度和特异性高的检测方法用于甲状腺癌的辅助诊断，作为“金标准”穿刺活检的补充。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。具有发夹结构的pre-microRNA是成熟microRNA的前体，其长度大约为70-80个核苷酸，其形成发夹结构的两个臂可以分别产生不同的成熟microRNA。早先时候，科学家们并没有严格地区分这种分别来自同一个条pre-microRNA的两条臂上的不同的microRNA，例如，都被命名为hsa-miR-146b，但是随着研究的不断深入，科学家们发现虽然是同一个pre-microRNA，但其所产生的成熟microRNA却有着很大的差别，不但基因序列不同，这些microRNA的功能也不同。因此新的命名规则被采纳，即以microRNA的成熟体产生于pre-microRNA的5’端臂还是3’端臂，分别加上后缀“-5p”和“-3p”分别命名（如hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p）。大量的研究表明，作为基因表达的关键调节因子，microRNA在癌组织中表达谱系发生显著的变化，若能够找到甲状腺良性结节与甲状腺癌中具有稳定表达差异的microRNA，就能够用于区分甲状腺结节的良恶性，而本专利技术主要就是为了解决这样的问题。hsa-miR-146b的前体是Pre-microRNA-146b，其形成发夹结构的两个臂可以分别产生两个成熟体microRNA，分别是hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p，但这两个独立的成熟microRNA，各自具有独特的靶向调控基因和生物学功能，在不同的生物学过程中扮演不同的角色，是两种完全不同的microRNA。虽然有很多文献报道发现hsa-miR-146b在甲状腺癌组织中高表达（PMID：28937915、PMID：29048684、PMID：24301304、PMID：20406109、PMID：26581891等），但通过序列比对，这些文献报道中所称的hsa-miR-146b均为hsa-miR-146b-5p。当然也有不少文献单独报道了hsa-miR-146b-5p在甲状腺癌组织中表达升高的情况（PMID：32103998、PMID：31839944）。但是，有关hsa-miR-146b-3p在甲状腺组织中的表达情况的研究报道并不多见，有些文献虽然发现了hsa-miR-146b-3p在甲状腺癌组织中的表达相比周围正常甲状腺组织有所升高（PMID：32637757、PMID:30244634），但却并没有披露hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节组织中的表达情况。在没有大量临床实验数据的支持下，并不能想当然地认为hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节中的表达一定会增高或降低。因此，仅仅通过现有的技术方案，显然无法充分地得出可以利用hsa-miR-146b-3p的表达情况来鉴别甲状腺结节良恶性的结论。而本专利技术通过大量的临床研究，证实hsa-miR-146b-3p在甲状腺良性结节组织与甲状腺癌组织中具有显著的表达差异，可作为分子标志物用于甲状腺结节的良恶性鉴别。不仅如此，如果同时检测hsa-miR-146b-5p和hsa-miR-146b-3p来鉴别甲状腺结节良恶性的准确性，也要明显优于单独检测hsa-miR-146b-5p的准确性。因此，本专利技术通过检测甲状腺结节中hsa-miR-146b-3p的表达情况，有助于进一步提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性，减少甲状腺结节患者的过度医疗，为国家节约医疗资源，无疑具有非常重大的临床价值和巨大的经济效益。
技术实现思路
本专利技术利用荧光定量PCR的检测方法，发现检测组织中的hsa-miR-146b-3p表达量变化能够用于甲状腺结节的良恶性鉴别，且具有较高的灵敏度和特异性，可以提高甲状腺结节良恶性鉴别的准确性。第一方面，本专利技术提供一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，所述组合物包括：hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQIDNO.1）；hsa-miR-146b-3p检测正向引物：CCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQIDNO.2）；通用反向引物：ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQIDNO.3）；内参基因U68逆转录茎环引物：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQIDNO.4）；内参基因U68检测正向引物：AGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQIDNO.5）。进一步地，所述组合物还包括阳性质控品和阴性质控品。阳性质控品为人工合成单链hsa-miR-146b-3pmimics：GCCCUGUGGACUCAGUUCUGGU（SEQIDNO.6）和人工合成内参基因U68的RNAmimics：AUUGCACCUAAACCCAAGAAUCACUGUUUCUUAUAGCGGUGGUUUAAACAGAGGUGCAAACAGCAAGCGGAUCUUGUCGCCUUUGGGGGGCUGUGGCCGUGCCCCUCAAAGUGAAUUUGGAGGUUCCACAACU（SEQIDNO.7）的混合物；阴性质控品为人工合成单链cel-mir-39-3pmimics：UAUACCGAGAGCCCAGCUGAUUUCGUCUUGGUAAUAAGCUCGUCAUUGAGAUUAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUGGCUCUGGUGUC（SEQIDNO.8）。第二方面，本专利技术提供了上述组合物在制备鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒中的用途。具体的，其使用方法包括如下步骤：（1）使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，其特征在于，所述组合物包括：/nhsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：/nGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQ ID NO.1）；/nhsa-miR-146b-3p检测正向引物：/nCCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQ ID NO.2）；/n通用反向引物：/nATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQ ID NO.3）；/n内参基因U68逆转录茎环引物：/nGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQ ID NO.4）；/n内参基因U68检测正向引物：/nAGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQ ID NO.5）。/n

【技术特征摘要】
1.一种鉴别甲状腺结节良恶性的组合物，其特征在于，所述组合物包括：
hsa-miR-146b-3p逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCAGA（SEQIDNO.1）；
hsa-miR-146b-3p检测正向引物：
CCTGTGGACTCAGTTCTG（SEQIDNO.2）；
通用反向引物：
ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG（SEQIDNO.3）；
内参基因U68逆转录茎环引物：
GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGTTGTGG（SEQIDNO.4）；
内参基因U68检测正向引物：
AGAGGTGCAAACAGCAAGC（SEQIDNO.5）。


2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括阳性质控品和阴性质控品。


3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，阳性质控品为人工合成单链hsa-miR-146b-3pmimics：GCCCUGUGGACUCAGUUCUGGU（SEQIDNO.6）和人工合成内参基因U68的RNAmimics：AUUGCACCUAAACCCAAGAAUCACUGUUUCUUAUAGCGGUGGUUUAAACAGAGGUGCAAACAGCAAGCGGAUCUUGUCGCCUUUGGGGGGCUGUGGCCGUGCCCCUCAAAGUGAAUUUGGAGGUUCCACAACU（SEQIDNO.7）的混合物；阴性质控品为人工合成单链cel-mir-39-3pmimics：UAUACCGAGAGCCCAGCUGAUUUCGUCUUGGUAAUAAGCUCGUCAUUGAGAUUAUCACCGGGUGUAAAUCAGCUUGGCUCUGGUGUC（SEQIDNO.8）。


4.如权利要求1~3所述的组合物在制备鉴别甲状腺结节良恶性的试剂盒中的用途，其特征在于，使用方法包括如下步骤：

【专利技术属性】
技术研发人员：宣涛，张宇清，裴婷婷，
申请(专利权)人：上海润安医学科技有限公司，润安医学科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31