一种用于检测甲状腺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测甲状腺肿瘤的分级模型及其应用，所述模型通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量对印记基因在甲状腺肿瘤中的变化进行分级，其中，所述印记基因为Z1、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。本发明专利技术所述检测模型和装置，以直观的方法表现了印记缺失在甲状腺肿瘤病人的组织和细胞样本上的表现，通过对印记基因原位标记的方法，客观、直观、早期、精确地检测出印记(迹)基因的变化，并可以提供量化的模型，为甲状腺肿瘤的诊断做出巨大贡献。

A grading model for detecting the benign and malignant degree of thyroid tumor and its application

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测甲状腺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用
本专利技术涉及生物
，涉及基因诊断领域，涉及一种用于检测甲状腺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用，具体涉及一组印记基因在检测甲状腺肿瘤良恶性程度中的分级模型及其组成的装置。
技术介绍
根据世界卫生组织统计，2012年甲状腺癌全球新增病例298,100例，中国新诊断病例约90,000例，美国新诊断病例约25,520例。大多数甲状腺癌分化程度较高，具有极好预后，5年生存率高于95％，但是一部分甲状腺癌在肿瘤很小的时期就发生转移。此外，分化较低的甲状腺甲状腺癌可以是致命的，其生存时间中值范围为4个月到5年。目前甲状腺癌的病理诊断难点包括良性的滤泡性甲状腺瘤(FTA)和恶性的滤泡性甲状腺癌(FTC)之间的鉴别，以及甲状腺嗜酸细胞肿瘤(HCT)的良恶性判断，目前仅有的BRAF基因检测只能用于甲状腺乳头状癌的检测，对FTC和HCT的诊断没有作用。我国在过去的十年间，甲状腺癌的发病率增加了4.6倍，并且还在继续增长中，目前每年的新增的甲状腺癌的患者约有10万人左右，其中难以诊断的滤泡状甲状腺腺癌和嗜酸性细胞甲状腺瘤约占10％左右，加上3-4倍的疑似病例，预计每年大约有4-5万病例需要明确诊断，再加上全球的患者，这一数字将增加到10万以上，因此亟需开发一种准确率更高的检测技术。传统病理学对细胞的良恶性诊断是基于细胞的大小，形态，侵润性和周边细胞组织的关系来作出判断的。它对细胞(癌症)的早期变化的发现有很大的局限性，因此细胞分子水平的癌症诊断方法，一度成为研究热点。随着人们在分子生物学领域的不断深入研究，越来越多的分子检测技术被运用到癌症诊断中。癌症的产生是随时间推移而累积的表观遗传改变和基因上的变异所导致的不受控制的细胞生长/分裂。传统病理学诊断根据细胞和组织的大小，形态和结构上的变异，从而做出甲状腺肿瘤良恶性判断。随着分子生物学的发展与深入，越来越多的分子检测技术被应用于甲状腺癌症的检测。从癌症的发展过程分析，分子层面的改变(表观遗传学和基因学)远早于细胞形态和组织结构的变异。所以分子生物学检测对癌症早期的检测更敏感。基因组印记是表观遗传学中基因调控的一种方式。其特点是，通过甲基化来自特定亲代的等位基因，使某个基因只有一个等位基因表达，而另一个则陷入基因沉默状态。该种类的基因，被称为印迹(记)基因。印迹缺失是印迹基因去甲基化导致沉默状态的等位基因被激活并且开始基因表达的一种表观遗传改变。大量研究表明，该现象(印迹缺失)普遍存在于各类癌症并且发生时间早于细胞和组织形态改变。与此同时，在健康细胞中，印迹缺失比例极低，与癌细胞成鲜明对比。所以，印迹基因的甲基化状态可以作为病理标记，通过特定分子检测技术，对细胞异常状态进行分析。基于上述原因，目前的甲状腺癌诊断需要新的检测系统和检测模型，基于患者活检样本，解析甲状腺癌在细胞层面上存在的分子标记物变化，以此提供更精确的预诊和诊断信息。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供了一种用于检测甲状腺肿瘤良恶性程度的分级模型及其应用，该检测装置和模型是用于单细胞和组织水平下早期直观地观察甲状腺肿瘤的印记(迹)基因的变化从而判断甲状腺肿瘤的良恶性程度。为达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种用于甲状腺肿瘤的印记基因分级模型，所述模型通过计算印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量在甲状腺癌中的变化对印记基因的表达状态进行分级；其中，所述印记基因为Z1、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。本专利技术中，专利技术人发现通过计算Z1、Z11和Z16中任意一个印记基因在甲状腺肿瘤中的印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到64.3％以上。根据本专利技术，若初步检测只检测一个印记基因，可以检测Z1、Z11和Z16中的任意一个，优选为Z1或Z11中的任意一个，进一步优选为Z1。本专利技术中，专利技术人发现，若单独检测一个Z1印记基因，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到84.8％，若单独检测一个Z11印记基因，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到66.7％，若单独检测一个Z16印记基因，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到64.3％。根据本专利技术，所述模型计算印记基因的方法为：若检测印记基因的两个印记基因的组合，所述组合可以是Z1、Z11和Z16中的任意两个，优选为Z1和Z11的组合，Z1和Z16的组合。本专利技术中，专利技术人发现通过计算两个或两个以上的印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量可以进一步提高敏感度，检测印记基因Z1、Z11和Z16中的任意两个印记基因的组合，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到84.6％以上，检测Z1和Z16的组合时，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到92.9％，检测Z1和Z11的组合时，对甲状腺癌的诊断敏感度可以达到97.5％以上。根据本专利技术，所述印记基因还包括Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10或Z13中的任意一个或至少两个的组合；其中，所述印记基因Z3为Peg10，所述印记基因Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z13为Sgce。本专利技术中，专利技术人发现在使用Z1、Z11和Z16基因检测的基础上再增加Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z13基因进行联合诊断，不仅有助于增加检测的准确度，而且增加其他探针辅助诊断可以进一步避免假阳性的出现，能够将检测准确度进一步提高，从而能够实现所有甲状腺肿瘤样本的精确分级和判断。根据本专利技术，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，计算Z1、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16基因的组合。本专利技术中，所述印记基因缺失为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，所述印记基因拷贝数异常为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，所述拷贝数异常是由于癌细胞异常地进行基因复制，导致这个基因表达时呈现为三倍体甚至更高的多倍体的情况。本专利技术中，所述印记基因与印迹基因同时一个概念，表示同一个意思，可以进行替换。优选地，所述计算印记基因表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；印记基因缺失基因表达量(LOI)＝c/(b+c+d)×100％；印记基因拷贝数异常的基因表达量(CNV)＝d/(b+c+d)×100％；其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于甲状腺肿瘤的印记基因分级模型，其特征在于，所述模型通过计算印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量在甲状腺肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；/n其中，所述印记基因为Z1、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于甲状腺肿瘤的印记基因分级模型，其特征在于，所述模型通过计算印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量在甲状腺肿瘤中的变化对印记基因的表达状态进行分级；
其中，所述印记基因为Z1、Z11或Z16中的任意一个或至少两个的组合，所述印记基因Z1为Gnas，所述印记基因Z11为Grb10，所述印记基因Z16为Snrpn/Snurf。


2.根据权利要求1所述的模型，其特征在于，所述模型计算印记基因的方法如下：
计算Z1、Z11或Z16中的任意一个，优选为Z1或Z16，进一步优选为Z1；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算Z1、Z11或Z16中的任意两个，优选为Z1和Z16的组合，Z1和Z11的组合。


3.根据权利要求1或2所述的模型，其特征在于，所述印记基因还包括Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10或Z13中的任意一个或至少两个的组合；其中，所述印记基因Z3为Peg10，所述印记基因Z4为Igf2r，所述印记基因Z5为Mest，所述印记基因Z6为Plagl1，所述印记基因Z8为Dcn，所述印记基因Z10为Gatm，所述印记基因Z13为Sgce；
优选地，所述模型计算印记基因的方法为：计算印记基因的组合，计算Z1、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的十个印记基因的组合。


4.根据权利要求1-3中任一项所述的模型，其特征在于，所述计算印记基因的总表达量、印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的公式如下：
总表达量＝(b+c+d)/(a+b+c+d)×100％；
正常印记基因表达量＝b/(b+c+d)×100％；
印记基因缺失基因表达量＝c/(b+c+d)×100％；
印记基因拷贝数异常的基因表达量＝d/(b+c+d)×100％；
其中，所述a为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内不存在标记，印记基因没有表达的细胞核；所述b为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在一个红色/棕色标记，印记基因存在的细胞核；所述c为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个红色/棕色标记，印记基因缺失的细胞核；所述d为将细胞进行苏木素染色后，细胞核内存在两个以上红色/棕色标记，印记基因拷贝数异常的细胞核。


5.根据权利要求1-4中任一项所述的模型，其特征在于，所述印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量分成五个不同的等级；
优选地，所述五个不同的等级为针对Z1、Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11、Z13和Z16的十个印记基因的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和印记基因总表达量分别进行划分的五个不同的等级；
优选地，所述针对Z1和Z16的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量小于12％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量小于1％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量小于25％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为12-20％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为1-2％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为25-35％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为2-3％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为35-45％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量为25-30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量为3-5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量为45-60％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z1和Z16的印记基因缺失表达量大于30％、所述印记基因Z1和Z16的印记基因拷贝数异常表达量大于5％或所述印记基因Z1和Z16的总表达量大于60％中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述针对Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量划分的五个不同的等级为：
0级：所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量小于10％、所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量小于0.5％或所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的总表达量小于15％中的任意一种或至少两种的组合；
I级：所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为10-15％、所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为0.5-1％或所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的总表达量为15-20％中的任意一种或至少两种的组合；
II级：所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为15-20％、所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为1-2％或所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的总表达量为20-30％中的任意一种或至少两种的组合；
III级：所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量为20-25％、所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量为2-3％或所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的总表达量为30-40％中的任意一种或至少两种的组合；
IV级：所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因缺失表达量大于25％、所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的印记基因拷贝数异常表达量大于3％或所述印记基因Z3、Z4、Z5、Z6、Z8、Z10、Z11和Z13的总表达量大于40％中的任意一种或至少两种的组合。


6.一种检测甲状腺肿瘤良恶性程度的装置，其特征在于，包括如下单元：
(1)取样单元：获取待测样本；
(2)探针设计单元：根据印记基因序列设计特异性引物；
(3)检测单元：将步骤(2)的探针与待测样本进行原位杂交；
(4)分析单元：显微镜成像分析印记基因的表达情况；
其中，所述分析单元通过计算印记基因缺失表达量、印记基因拷贝数异常表达量和总表达量，通过权利要求1-5中任一项所述的模型，从而通过印记基因缺失表达量和印记基因拷贝数异常表达量的等级来判断甲状腺肿瘤的良恶性程度。


7.根据权利要求6所述的装置，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：成彤，周宁，
申请(专利权)人：立森印迹诊断技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32