用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法技术

本发明专利技术提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，包括三组引物和双探针如序列表所示；同时提供一种荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法。本发明专利技术采用实时荧光定量PCR Taqman‑MGB探针的方法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman‑MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本发明专利技术建立的CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。

Detection of CYP2C9 and VKORC1 gene polymorphisms by fluorescence quantitative PCR

【技术实现步骤摘要】
用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法
本专利技术涉及基因检测
，尤其是涉及用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合及检测方法。
技术介绍
华法林是目前临床上广泛使用的维生素K拮抗剂类口服抗凝血药，用于静脉血栓栓塞、心肌梗死、缺血性脑卒中、心脏瓣膜置换术后、房颤等的抗凝治疗和预防。目前临床使用的华法林制剂是S-华法林和R-华法林的消旋体混合物，其中S-华法林的抗凝活性是R-华法林的2.7～3.8倍，在体内主要由肝脏细胞色素P4502C9(CYP2C9)进行代谢。CYP2C9基因编码区存在着单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphism，SNPs)，其中比较重要的是CYP2C9*2和CYP2C9*3，具有这两种突变的个体所需华法林剂量明显降低，出血的风险也随之增加。另外，维生素K环氧化物环氧化酶复合体1(VKORC1)是体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶，华法林可竞争性抑制此酶的作用而达到抗凝效果。因此在临床用药过程中，应首先对患者进行CYP2C9和VKORC1的基因多态性检测，再加上年龄、性别和体重解释约61％的华法林个体用药差异。目前，根据不同基因型和年龄、体重的组合来调节华法林个体化用药的剂量公式已经比较完善。目前，对于CYP2C9和VKORC1基因多态性检测的方法有很多种，如直接测序法、焦磷酸测序法、实时荧光定量PCR(QPCR)、等位基因特异性扩增法(ARMS)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。
技术实现思路
为了解决上述缺陷，本专利技术的技术目的是提供用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合及检测方法，该方法运用引物与双探针组合的检测方法，具有结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。为了达到上述目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，包括三组引物和双探针，其中：第一组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.1所示，下游引物由SEQIDNO.2所示，荧光探针1由SEQIDNO.3所示，荧光探针2由SEQIDNO.4所示；第二组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.5所示，下游引物由SEQIDNO.6所示，荧光探针1由SEQIDNO.7所示，荧光探针2由SEQIDNO.8所示；第三组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.9所示，下游引物由SEQIDNO.10所示，荧光探针1由SEQIDNO.11所示，荧光探针2由SEQIDNO.12所示。本专利技术的引物探针组合尤其是针对CYP2C9基因多态性：CYP2C9基因的CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点、和VKORC1基因多态性：VKORC1基因-1639A＞G位点的检测所特别设计的，可以高效率、高特异性、准确地扩增出CYP2C9基因、VKORC1基因的特异性基因片段。本专利技术的引物探针组合，所述三组的荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，各组中的荧光探针1和荧光探针2的荧光基团均不相同。其中所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、TexasRed-X、Cy3、Cy5中的任意一种；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB中的任意一种。根据本专利技术一种最优选的实施方案，荧光探针的选择是：荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。本专利技术采用实时荧光定量PCRTaqman-MGB探针的方法检测CYP2C9和VKORC1基因多态性，并且采用了野生型与突变型双探针的检测方法，不但提高了特异性，还降低了成本；Taqman-MGB探针在实验结果的准确性、重复性、特异性、灵敏度等方面均优于普通的探针。因此，本专利技术建立的CYP2C9和VKORC1基因多态性的方法存在结果准确、特异性灵敏度高、无毒害无污染、成本低廉、快速高效等优点。经过多次试验证明，本专利技术提供的引物探针组合具有较好的特异性和扩增准确性，可以应用于制备荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的试剂盒，通过制备成成品试剂盒，可以在采集了样品试验后，快速准确地得出CYP2C9和VKORC1基因多态性的结果。所述试剂盒，主要是包括本专利技术提供的引物探针组合，其中引物的终浓度优选为：上下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM。其他PCR试剂可以根据常规技术选择，例如优选的技术方案是，还包含DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs和超纯水。在制作成品试剂盒时，还可以根据实际需要，选择性的配置用于提取样品DNA的试剂或者专业的DNA提取试剂盒；可以更方便快捷地得到待检测样品的DNA，增强本专利技术的检测成品试剂盒的使用方便和快捷性。所述待测样品可以为任何含有基因组DNA的血液、细胞、组织或口腔拭子样品。在本专利技术提供的引物探针的基础上，本专利技术进一步提供一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的检测方法，采用所述的引物探针进行荧光定量PCR检测。根据一种优选的实施方式，所述检测方法的具体步骤是：(1)从待测样品中提取基因组DNA，作为扩增模板；(2)配制包含所述引物探针组合和所述扩增模板的荧光定量PCR反应体系，各反应体系中，上下游引物的终浓度均为0.2-1.0μM；荧光探针的终浓度均为0.05-1.0μM；PCR扩增体系1(CYP2C9*2)，包括：2×TaqManPCR反应混合物(DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP))、扩增CYP2C9*2位点的上下游引物(第一组引物对)和野生型、突变型特异性荧光探针(第一组荧光探针1和荧光探针2)、超纯水和DNA模板，反应体系体积为10-50μl；PCR扩增体系2(CYP2C9*3)，包括：2×TaqManPCR反应混合物(DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP))、扩增CYP2C9*3位点的上下游引物(第二组引物对)和野生型、突变型特异性荧光探针(第二组荧光探针1和荧光探针2)、超纯水和DNA模板，反应体系体积为10-50μl；PCR扩增体系3(VKORC1-1639A＞G)，包括：2×TaqManPCR反应混合物(DNA聚合酶、缓冲液、尿嘧啶DNA糖基酶、dNTPs(含dUTP))、扩增VKORC1-1639A＞G位点的上下游引物(第三组引物对)和野生型、突变型特异性荧光探针(第三组荧光探针1和荧光探针2)、超纯水和DNA模板，反应体系体积为10-50μl；(3)荧光PCR扩增反应，条件：90-98℃，预变性，5-20min；94-98℃变性10-50s；55-69℃，退本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，其特征在于，包括三组引物和双探针，其中：/n第一组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.1所示，下游引物由SEQ IDNO.2所示，荧光探针1由SEQ ID NO.3所示，荧光探针2由SEQ ID NO.4所示；第二组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.5所示，下游引物由SEQ ID NO.6所示，荧光探针1由SEQ ID NO.7所示，荧光探针2由SEQ ID NO.8所示；第三组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQ ID NO.9所示，下游引物由SEQ ID NO.10所示，荧光探针1由SEQ ID NO.11所示，荧光探针2由SEQ ID NO.12所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于荧光定量PCR检测CYP2C9和VKORC1基因多态性的引物探针组合，其特征在于，包括三组引物和双探针，其中：
第一组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.1所示，下游引物由SEQIDNO.2所示，荧光探针1由SEQIDNO.3所示，荧光探针2由SEQIDNO.4所示；第二组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.5所示，下游引物由SEQIDNO.6所示，荧光探针1由SEQIDNO.7所示，荧光探针2由SEQIDNO.8所示；第三组引物探针的核苷酸序列：上游引物由SEQIDNO.9所示，下游引物由SEQIDNO.10所示，荧光探针1由SEQIDNO.11所示，荧光探针2由SEQIDNO.12所示。


2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述CYP2C9基因多态性包括CYP2C9基因的CYP2C9*2位点、CYP2C9*3位点；所述VKORC1基因多态性包括VKORC1基因-1639A＞G位点。


3.根据权利要求1或2所述的引物探针组合，其特征在于，所述三组的荧光探针在5′末端区域标记有荧光基团，在3′末端区域标记有淬灭基团，各组中的荧光探针1和荧光探针2的荧光基团均不相同。


4.根据权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、TET、VIC、ROX、TexasRed-X、Cy3、Cy5；淬灭基团选自TAMRA、BHQ、DABCYL、NFQ-MGB。


5.根据权利要求3或4所述的引物探针组合，其特征在于，所述三组的荧光探针，荧光探针1的5′端标记有FAM的荧光基团，荧光探针2的5′端标记有VIC荧光基团，所有荧光探针的3′端均标记有NFQ-MGB的淬灭基团。


6.权利要求1-5任...

【专利技术属性】
技术研发人员：刁久玲，翟瑞雪，智慧芳，倪君君，
申请(专利权)人：北京和合医学诊断技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11