一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法技术

一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，先对提取的DNA进行含量的鉴定；再分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，借助实时荧光定量PCR MGB探针法分别对性别位点A和B进行扩增和鉴定；本发明专利技术设定两种性别扩增基因相结合，两种性别基因鉴定结果可以互相补充和验证，大大增加了古代人类遗骸性别鉴定结果的可靠性；本发明专利技术方法所用的古DNA模板量较少，只要1.5μl就可以完成模板定量两种性别基因鉴定整个过程；实时荧光定量PCR技术的应用，相对于传统PCR扩增和凝胶电泳验证步骤，缩短了实验时间和减少了操作步骤，提高了检测灵敏性和效率。

A Sex Identification Method for Ancient Human Remains with Very Low DNA Content

【技术实现步骤摘要】
一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法
本专利技术涉及分子考古学领域，特别涉及一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法。
技术介绍
中国现代考古学是以一群具有明确特征、经常伴随出现的器物类型作为区分不同文化的标志，这样的考古理念，恰恰把创造历史文化的人排除在外，实际上无论是远古还是现代，人类永远是社会活动的主体，人类社会最关心的应该是人类本身。因此，古DNA分子人类学在我国的兴起正是要打破这种单一的、形态上对应的文化定性研究模式，把古代人类生命物质遗存的所有信息注入人类历史研究过程，从而把人类历史研究拉上以人为核心的研究轨道上来，使人类学、考古学和生命科学交叉融合共同发展。古代人类遗骸的性别信息是考古学研究必不可少的关键信息之一。只有准确的知道墓葬群中个体的性别信息，才能进一步去研究家庭结构，社会结构等重要的科学问题。传统的古代人类遗骸性别鉴定方法以形态学分析为主，性别判定主要依据头骨、盆骨及四肢骨等骨骼的性别标志。骨骼保存完整程度的不同，鉴定结果的准确程度也不同。对于年龄过小的个体难以用形态学方法作出性别判断。这些年随着分子生物学的发展，开始用牙釉质蛋白(Amelogenin)基因进行古人类的性别鉴定，Amelogenin基因通常在X和Y染色体上分布的片段长度不同，用普通的PCR对Amelogenin基因进行扩增，然后用凝胶电泳检测，出现106bp和112bp两条带的是男性，只出现106bp一条带的是女性。该方法的发现，推动了古代人类遗骸性别鉴定的发展，特别是实现了对于年龄较小的遗骸进行性别鉴定的可能性。但是对于保存情况较差的遗骸，古DNA含量极低且降解严重，电泳很难达到古DNA条带的检测限，X或者Y染色体上的基因可能只扩增出一个条带，按照性别分析方法，女性通常是一条带，而男性为两条带，这样就会出现误读，影响结果的真实性，大大降低了性别结果的可靠性。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，只要1.5μl模板量就可以完成整个性别鉴定过程，分别设定两对性别鉴定位点互相补充和验证，借助实时荧光定量PCRMGB探针法分别对位点进行扩增和鉴定，极大的提高了检测灵敏性，对于保存较差的古代人类遗骸性别鉴定提高了效率。为了实现上述目的，本专利技术采取如下的技术解决方案：一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，包括以下步骤：步骤一、古DNA的提取步骤二、古DNA的定量选择人类线粒体DNA序列，设计一段113bp长的DNA片段，并设计好探针，同时合成引物和探针，如表1，表1古DNA的定量引物制备标准品包括：PCR扩增目标片段，PCR产物的纯化，重组质粒的转染，菌落PCR，菌落PCR成功的细菌进行恒温培养，摇菌过夜，质粒的提取，保准品制备完成。用实时荧光定量PCRSYBR方法对标准品和古DNA样品进行扩增，根据标准品的扩增结果，绘制标准曲线，进而计算古DNA样品绝对定量结果。步骤三、性别位点A引物的合成Amelogenin基因通常在X和Y染色体上分布的片段长度不同，电泳后出现106bp和112bp两条带的是男性，只出现106bp一条带的是女性，合成引物见表2。表2Amelogenin基因扩增引物步骤四、性别位点B引物的合成用3个特异性性别引物分别对样本X和Y染色体片段进行扩增，引物M4作用于X和Y染色体5'端；引物M5只作用于X染色体3'端；而M6仅作用于Y染色体3'端；X染色体扩增产物片段大小为330bp；Y染色体扩增产物片段大小为218bp，引物M4、M5和M6序列见表3；表3性别基因扩增引物步骤五、两对性别位点的结合：分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，将性别位点A和B进行整合，作为古代人类遗骸性别鉴定的Markers。步骤六、性别位点A和B的扩增和鉴定合成MGB探针，用实时荧光定量PCR探针法，使用NEBLunaUniversalProbeQpcrMasterMix，M3004，同时对性别位点A和B进行扩增，将性别位点A和B的扩增结果放在一起综合分析，最后得到古人类遗骸个体性别信息。步骤一所述的古DNA的提取，具体为：(1)称取0.5～2g骨粉，加入1ml的10％SDS；4ml的pH8.0的EDTA和100μl的10mg/ml蛋白酶K，于37℃震荡过夜；过夜后的DNA提取样品转入空气浴中震荡，于55℃继续震荡温浴6h，然后于95℃放置5min，使多余的蛋白酶K失活；(2)将步骤(1)产物7500r/min离心8min后，取800μl上清液加入到超滤离心管中，6800r/min离心，将裂解液浓缩到100μl；(3)加入300μl结合缓冲液和20μl的磁珠悬浮液颠倒混匀10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠吸附到侧壁，吸走离心管内液体，所述的结合缓冲液为5MGuSCN，25mMNaCl和50mMTris的混合物；(4)加入500μl洗涤缓冲液轻柔颠倒数次，利用磁力架吸附磁珠，1min后吸走管内液体，洗涤过程重复一次，洗涤缓冲液为125mMNaCl、10mMTris、pH8.0的1mMEDTA以及占总体积50％的乙醇；(5)取下离心管，加入50～100μl的TE洗脱液，使磁珠悬浮，55℃水浴10min，将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将洗脱液转移至干净的离心管中，得到古DNA提取溶液；TE洗脱液为10mMTris和pH8.0的1mMEDTA混合物。步骤二所述的计算古DNA样品绝对定量结果，具体为：用NEB公司的LunaUniversalqPCRMasterMix，M3003做实时荧光定量PCR，标准品每个重复三次，模板上样量0.5μl，总体系20μl；qPCR扩增反应条件：95℃60s；95℃15s，60℃30s，40个循环。所述步骤六具体为：PCR体系：ProbeqPCRmix10ul，20uM正向引物0.5μl，20uM的反向引物0.5μl，10uM的Probe-AMGX0.4μl，10uM的Probe-AMGY0.4μl，模板DNA0.5μl，加水让总体积达到20μl；PCR扩增反应条件：95℃60s；95℃15s，60℃30s，40个循环；利用上述反应体系和反应条件，借助96孔板在实时荧光定量PCR仪上运行，综合分析得到性别位点扩增结果，根据扩增结果获得样本的性别信息。本专利技术优点：1、分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域。借助实时荧光定量PCRMGB探针法分别对性别位点A和B进行扩增和鉴定，本专利技术设定两种性别扩增基因相结合，两种性别基因鉴定结果可以互相补充和验证，大大增加了古代人类遗骸性别鉴定结果的可靠性。2、本方法所用的古DNA模板量较少，只要1.5μl模板量就可以完成整个性别鉴定过程，3、实时荧光定量PCR技术的应用，相对于传统PCR扩增和凝胶电泳验证步骤，缩短了实验时间和减少了操作步骤，更重要的是极大的提高了检测灵敏性，对于保存较差的古代人类遗骸性别鉴定提高了效率。附图说明图1古DNA的定量结果。图2三个特异性性别引物扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、古DNA的提取步骤二、古DNA的定量选择人类线粒体DNA序列，设计一段113bp长的DNA片段，并设计好探针，同时合成引物和探针，如表1，表1古DNA的定量引物

【技术特征摘要】
1.一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、古DNA的提取步骤二、古DNA的定量选择人类线粒体DNA序列，设计一段113bp长的DNA片段，并设计好探针，同时合成引物和探针，如表1，表1古DNA的定量引物制备标准品包括：PCR扩增目标片段，PCR产物的纯化，重组质粒的转染，菌落PCR，菌落PCR成功的细菌进行恒温培养，摇菌过夜，质粒的提取，保准品制备完成；用实时荧光定量PCRSYBR方法对标准品和古DNA样品进行扩增，根据标准品的扩增结果，绘制标准曲线，进而计算古DNA样品绝对定量结果；步骤三、性别位点A引物的合成Amelogenin基因通常在X和Y染色体上分布的片段长度不同，电泳后出现106bp和112bp两条带的是男性，只出现106bp一条带的是女性，合成引物见表2；表2Amelogenin基因扩增引物步骤四、性别位点B引物的合成用3个特异性性别引物分别对样本X和Y染色体片段进行扩增，引物M4作用于X和Y染色体5'端；引物M5只作用于X染色体3'端；而M6仅作用于Y染色体3'端；X染色体扩增产物片段大小为330bp；Y染色体扩增产物片段大小为218bp，引物M4、M5和M6序列见表3；表3性别基因扩增引物步骤五、两对性别位点的结合：分别设定两对性别鉴定位点，并标记为性别位点A和B，性别位点A是牙釉质蛋白基因，性别位点B是X和Y染色体上的一段保守区域，将性别位点A和B进行整合，作为古代人类遗骸性别鉴定的Markers；步骤六、性别位点A和B的扩增和鉴定合成MGB探针，用实时荧光定量PCR探针法，使用NEBLunaUniversalProbeQpcrMasterMix，M3004，同时对性别位点A和B进行扩增，将性别位点A和B的扩增结果放在一起综合分析，最后得到古人类遗骸个体性别信息。2.根据权利要求1所述的一种针对DNA含量极低的古代人类遗骸性别鉴定方法，其特征在于，步骤一所述的古DNA的提取，具体为：(1)称取0.5～2g骨粉，加入1ml的10％SDS；4ml的pH8.0的EDTA和100μl的10mg/ml蛋白酶K，于37℃震荡过夜；过夜后的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张虎勤，赵静，吴晓明，刘晓刚，杜建强，林松，胡曦，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61