缓冲液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了缓冲液及其应用，其中，该缓冲液包括：33‑66mM Tris缓冲液，1.6‑5mM二价阳离子、25‑75mM一价阳离子、0.5‑10mM二硫苏糖醇(DTT)、5‑15％PEG4000‑8000和0.5‑2mM ATP，pH值为7‑9。该缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。

Buffer and its application

【技术实现步骤摘要】
缓冲液及其应用
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及缓冲液及其应用，更具体地，涉及一种缓冲液、一种试剂盒、该缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，以及一种构建核酸文库的方法。
技术介绍
构建二代测序文库的一般流程包括：(1)对目的DNA片段化；(2)对游离DNA进行末端平齐化处理；(3)在平齐化后的DNA的3’末端突出腺苷酸化；(2)将突出腺苷酸化的DNA片段与突出胸腺嘧啶化的双链Y型接头进行连接。文库构建的目的即为在双链DNA片段两段加上接头。而文库转化率为测得产量与理论最高产量质检的比值，即有多少起始样本被最终转化为两段接有接头的片段。转化率很大程度上受连接效率的影响，连接反应效率与酶反应效率、DNA链末端开放性、供体和受体的碰撞效率等多个因素相关，同时在连接反应体系中的接头还会产生自连消耗反应中的有效接头数量，是文库构建过程中的一个效率瓶颈。目前市场上通用的快速连接缓冲液其连接反应平台期高度有限，存在增大酶投入量以克服缓冲体系不匹配等情况，提高了实际应用的成本；另外在现有的连接缓冲液下连接时间无法向前推动酶反应平衡；且在预混过程中会产生大量错配降低了文库产量，限制了高通量工作流程的搭建。由此，现有的连接缓冲液有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出一种缓冲液，该缓冲液有利于提高连接反应效率，降低错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种缓冲液。根据本专利技术的实施例，该缓冲液包括：33-66mMTris缓冲液，2-15mM二价阳离子、25-75mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mMATP，pH值为7-9。本专利技术实施例的缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率，并且兼容性好，对连接酶的抑制作用小，同时，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。另外，根据本专利技术上述实施例的缓冲液还可以具有如下附加的技术特征：根据本专利技术的实施例，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，为Tris-醋酸缓冲液。根据本专利技术的实施例，所述Tris-醋酸缓冲液的浓度为33-40mM。根据本专利技术的实施例，所述二价阳离子为Mg2+或Mn2+，优选地，为Mg2+。根据本专利技术的实施例，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-5mM。根据本专利技术的实施例，所述PEG4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％。根据本专利技术的实施例，所述PEG4000-8000为PEG4000和/或PEG6000。根据本专利技术的实施例，所述pH值为8。根据本专利技术的实施例，所述缓冲液包括：33-66mMTris-醋酸缓冲液，5-10mMMg2+、45-55mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG6000和0.5-2mMATP，pH值为7-9。根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种试剂盒。根据本专利技术的实施例，该试剂盒包括前述的缓冲液。本专利技术实施例的试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供了前述的缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液。本专利技术实施例的前述缓冲液在构建核酸文库中用于接头连接缓冲液，用于试剂盒的连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，试剂盒内的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。根据本专利技术的第四方面，本专利技术提供了一种构建核酸文库的方法。根据本专利技术的实施例，将预处理后的核酸与反应体系混合进行接头连接反应，其中，所述反应体系含有前述的缓冲液，且所述连接反应的时间为不低于10分钟，温度为16-37摄氏度。本专利技术实施例的构建核酸文库的方法，连接反应效率和底物的转化率高，连接反应的错配率低，并且兼容性好，该方法采用的缓冲液对连接酶的抑制作用小，体系用酶量小，试剂盒的成本低。其中，需要说明的是，该缓冲液具备前述缓冲液全部技术特征，在此不再一一赘述。根据本专利技术的实施例，所述连接反应的时间为10分钟至16小时，温度为20-30摄氏度。根据本专利技术的实施例，所述接头连接反应的连接酶为T4DNA连接酶。根据本专利技术的实施例，所述T4DNA连接酶的浓度为4-6U。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明本专利技术的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：图1显示了根据本专利技术一个实施例的T4DNA连接酶介导的连接反应示意图；图2显示了根据本专利技术一个实施例的不同浓度的一价阳离子的文库产量示意图；图3显示了根据本专利技术一个实施例的不同成分缓冲液的文库产量示意图；图4显示了根据本专利技术一个实施例的不同反应条件下的文库产量示意图；图5显示了根据本专利技术一个实施例的不同反应条件下的连接效率示意图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本专利技术的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。缓冲液根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种缓冲液。根据本专利技术的实施例，该缓冲液包括：33-66mMTris缓冲液，2-15mM二价阳离子、25-75mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mMATP，pH值为7-9。本专利技术实施例的缓冲液能提高连接反应效率，增加底物的转化率，降低连接反应的错配率；并且兼容性好，在一些实施例中，与通用缓冲体系配合使用，可以兼容打断、末端修复和加腺嘌呤(A)的过程，显著缩短了文库构建所需的时间，在一些具体的实施例中，仅需2小时就可以完成建库过程；并且，该缓冲液对连接酶的抑制作用小，显著降低体系用酶量，从而降低了实验的成本。根据本专利技术的一些实施例，在PEG4000-8000的存在下，单价阳离子会促进连接反应，并且单价阳离子的存在能够提高T4DNA连接酶的保真性，二本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种缓冲液，其特征在于，包括：/n33-66mM Tris缓冲液，2-15mM二价阳离子、25-75mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mM ATP，pH值为7-9。/n

【技术特征摘要】
1.一种缓冲液，其特征在于，包括：
33-66mMTris缓冲液，2-15mM二价阳离子、25-75mM一价阳离子、0.5-10mM二硫苏糖醇(DTT)、5-15％PEG4000-8000和0.5-2mMATP，pH值为7-9。


2.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述Tris缓冲液为Tris-盐酸缓冲液和/或Tris-醋酸缓冲液，优选地，为Tris-醋酸缓冲液。


3.根据权利要求2所述的缓冲液，其特征在于，所述Tris-醋酸缓冲液的浓度为33-40mM。


4.根据权利要求4所述的缓冲液，其特征在于，所述二价阳离子为Mg2+或Mn2+，优选地，为Mg2+，
任选地，所述一价阳离子为Na+或K+。


5.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述二硫苏糖醇的浓度为0.5-5mM。


6.根据权利要求1所述的缓冲液，其特征在于，所述PEG4000-8000的浓度为7-12％，优选地，为9-11％，更优选地，为10％，
任选地，所述PEG4000-8000为PEG4000和/或P...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘伟业，王亚蕾，程世月，李志民，李大为，玄兆伶，王海良，王娟，
申请(专利权)人：安诺优达基因科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11