一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法技术

本发明专利技术涉及高通量测序技术领域，具体涉及一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法。本发明专利技术利用用于模拟真实样品末端情况的模拟DNA模板构建文库，利用毛细管电泳检测文库中DNA片段的分布情况，根据所述DNA片段分布情况分析两端连接接头的DNA片段在所述文库中所占比例，分析文库构建过程的DNA转化效率。与传统的定量PCR方法相比，该方法具有操作简单、快速、可同时适用于多种测序平台的优势；同时，该方法具有较高的准确性，可更真实、全面地反映待评价的建库试剂或建库方法的DNA转化效率性能，对于文库构建试剂和方法的筛选以及提高文库构建的质量和效率具有重要意义。

A test method of DNA transformation efficiency constructed by high throughput sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法
本专利技术涉及高通量测序
，具体涉及一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法。
技术介绍
文库构建是二代测序过程中的核心步骤之一。文库构建过程包括末端补平、磷酸化、末端加A、接头连接和PCR扩增等过程。其中，末端补平、磷酸化、末端加A和接头连接效率的高低决定了原始模板转化为两端都连接上接头的DNA片段的效率(即DNA转化效率)的高低。文库构建过程的DNA转化效率是反映建库试剂和建库方法优劣的重要指标，是筛选建库试剂和建库方法的关键考虑因素。目前，在检测文库构建过程中的DNA转化效率时，需要对DNA模板中的DNA分子和构建文库中两端都连接上接头的DNA分子分别进行定量。对于DNA模板和两端连接上接头的DNA片段进行定量，通常使用定量PCR的方法，利用该方法检测文库构建过程中的DNA转化效率存在以下缺点：(1)需要针对原始DNA模板和两端都连接接头的DNA片段分别建立两个标准曲线，过程繁琐；(2)通过定量PCR进行DNA定量时，耗时较长；(3)由于不同测序平台所使用的接头序列不同，需要准备多种定量PCR引物配合不同测序平台使用；(4)受接头序列的影响，连接接头后的DNA分子进行定量PCR时很容易出现非特异扩增，导致定量不准确；(5)接头二聚体的残留会明显降低DNA转化效率检测的准确性。因此，开发快速、便捷、准确性较高的DNA转化效率的检测方法具有重要意义。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的技术问题，本专利技术的目的是提供一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用毛细管电泳技术区分两端连接接头和未连接接头的DNA片段，定量检测文库中DNA片段长度分布情况；在测序实践中，DNA样品需要先进行片段化处理，经片段化处理的DNA样品会产生不同类型的DNA片段，本专利技术在研发过程中发现在检测DNA转化效率时，由于不同类型的DNA片段在DNA修复过程以及与接头的连接效率不同，导致用于评价DNA转化效率的DNA模板类型极大地影响DNA转化效率评价的准确性，因此，本专利技术进一步针对毛细管电泳技术特点以及真实测序过程中片段化DNA样品的特点，设计了能够高效模拟真实的片段化DNA模板样品的各种末端情况的模拟DNA模板，将该模拟DNA模板进行文库构建后，再利用毛细管电泳检测文库中不同DNA片段的含量，进而开发了可用于建库试剂和建库方法筛选等建库优化过程的DNA转化效率检测方法。具体地，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法，利用用于模拟真实样品末端情况的模拟DNA模板进行文库构建，利用毛细管电泳检测所述文库中DNA片段的分布情况，根据所述DNA片段的分布情况分析两端连接接头的DNA片段在所述文库中所占比例。具体地，所述模拟DNA模板包括目的序列以及位于目的序列两侧的侧翼序列。通过在目的序列的两侧引入侧翼序列，可更加便于确定合成的模拟DNA模板的准确性。优选地，所述侧翼序列的长度为50～150bp。为能够更真实地反映文库构建过程中DNA转化效率的高低，所述目的序列优选为末端碱基平衡的序列。上述目的序列的选择可更有利于排除其他因素影响DNA转化效率。所述末端碱基平衡是指末端为A、T、G和C的DNA片段在所述模拟DNA模板中的含量相等。合适的模拟DNA模板长度能够更好地保证毛细管电泳的检测效率，优选地，所述模拟DNA模板的长度为100～350bp。以DNA为模板进行文库构建时首先需要将DNA片段的粘性末端修复为平末端。DNA片段通常存在两种粘性末端形式(如图1所示)，一种为5’端突出粘性末端，一种为3’端突出粘性末端。为更好地模拟真实样品模板的情况，提高DNA转化效率检测的准确性，本专利技术所述目的序列的5’端和3’端分别含有能够产生5’突出粘性末端和3’突出粘性末端的酶切位点，所述目的序列经酶切和末端修复后，其5’端和3’端的碱基相同。优选地，所述目的序列的5’端和3’端分别含有能够产生5’突出末端和3’突出末端的酶切位点。为更好地提高DNA转化效率检测的准确性，本专利技术所述目的序列优选包括经酶切后末端分别为A、T、G和C碱基突出的4种目的序列。作为本专利技术的一种优选实施方式，所述模拟DNA模板采用酶切的方法构建得到，其构建方法包括如下步骤：(1)分别扩增所述目的序列和所述侧翼序列；(2)将所述目的序列的扩增产物与所述侧翼序列的扩增产物拼接；(3)利用所述目的序列含有的酶切位点对应的酶对步骤(2)的拼接产物进行酶切，切除侧翼序列，分别得到末端分别为A、T、G和C碱基突出的4种DNA片段，将4种DNA片段等比例混合，得到所述所述模拟DNA模板。作为本专利技术的一种实施方式，上述4种目的序列的5’端和3’端包含的酶切位点分别如下：BamHI/PstI、NheI/KpnI、SalI/NsiI和EcoRI/EcoRI。作为本专利技术的具体示例，本专利技术以pUC57质粒序列为模板，合成模拟DNA模板，其中，如SEQIDNO.1(未融合侧翼序列)和SEQIDNO.5(两端融合侧翼序列)所示的序列经BamHI/PstI酶切后产生5’端和3’端突出为碱基G的模拟DNA模板；如SEQIDNO.2(未融合侧翼序列)和SEQIDNO.6(两端融合侧翼序列)所示的序列经NheI/KpnI酶切后产生5’端和3’端突出为碱基C的模拟DNA模板；如SEQIDNO.3(未融合侧翼序列)和SEQIDNO.7(两端融合侧翼序列)所示的序列经SalI/NsiI酶切后产生5’端和3’端为碱基T的模拟DNA模板；如SEQIDNO.4(未融合侧翼序列)和SEQIDNO.8(两端融合侧翼序列)所示的序列经EcoRI/EcoRI酶切后产生5’端和3’端突出为碱基A的模拟DNA模板。将上述4种碱基末端突出的酶切产物混合后即为模拟DNA模板，将该模拟DNA模板建库后，利用毛细管电泳检测其DNA转化效率，在保证快速、便捷的同时，具有较高的DNA转化效率检测准确性，可更为准确地评估建库试剂或建库方法的DNA转化效率。具体地，所述模拟DNA模板序列的构建方法包括如下步骤：(1)采用如SEQIDNO.12-19所示的引物扩增4种末端的目的序列；采用如SEQIDNO.20-23所示的引物扩增位于目的序列两侧的侧翼序列(5’和3’端侧翼序列分别如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示)；(2)将4种末端的目的序列的扩增产物分别与所述侧翼序列的扩增产物进行拼接；(3)利用所述目的序列含有的酶切位点对应的酶对步骤(2)的拼接产物进行酶切，切除侧翼序列，分别得到末端分别为A、T、G和C碱基突出的4种DNA片段，将4种DNA片段等比例混合，得到所述所述模拟DNA模板。在本专利技术所述模拟DNA模板的基础上，利用待评估DNA转化效率的文库构建试剂或文库构建方法对模拟DNA模板进行文库构建。文库构建基本流程可为：(1)末端修复和加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法，其特征在于，利用用于模拟真实样品末端情况的模拟DNA模板进行文库构建，利用毛细管电泳检测所述文库中DNA片段的分布情况，根据所述DNA片段的分布情况分析两端连接接头的DNA片段在所述文库中所占比例。/n

【技术特征摘要】
1.一种高通量测序文库构建的DNA转化效率的检测方法，其特征在于，利用用于模拟真实样品末端情况的模拟DNA模板进行文库构建，利用毛细管电泳检测所述文库中DNA片段的分布情况，根据所述DNA片段的分布情况分析两端连接接头的DNA片段在所述文库中所占比例。


2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述模拟DNA模板包括目的序列以及位于目的序列两侧的侧翼序列；
优选地，所述侧翼序列的长度为50～150bp。


3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，所述模拟DNA模板的长度为100～350bp；所述目的序列的末端碱基平衡。


4.根据权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于，所述目的序列的5’端和3’端分别含有能够产生5’突出粘性末端和3’突出粘性末端的酶切位点，所述目的序列经酶切和末端修复后，其5’端和3’端的碱基相同。


5.根据权利要求2～4任一项所述的检测方法，其特征在于，所述目的序列包括经酶切后末端分别为A、T、G和C碱基突出的4种目的序列。


6.根据权利要求1～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述模拟DNA模板的构建方法包括如下步骤：
(1)分别扩增所述目的序列和所述侧翼序列；
(2)将所述目的序列的扩增产物与所述侧翼序列的扩增产物拼接；
(3)利用所述目的序列含有的酶切位点对应的酶对步骤(2)的拼接产物进行酶切，切除侧翼序列，分别得到末端分别为A、T、G和C碱基突出的4种DNA片段，将4种DNA片段等比例混合，得到所述模拟DNA模板；
优选地，所述目的序列的5’端和3’端包含的酶切位点分别如下：BamHI/PstI、NheI/KpnI、SalI/NsiI和EcoRI/EcoRI。


7.根据权利要求1～6任一项所述的检测方法，其特征在于，分别将所述文库以及所述文库与所述模拟DNA模板的混合物进行毛细管电泳检测，分析其中未连接接头的DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵军，李韶妍，方楠，伍启熹，王建伟，刘倩，唐宇，
申请(专利权)人：北京优迅医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11