病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途技术

本发明专利技术涉及病毒核酸检测领域。具体地，本发明专利技术提供了一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将含有样本的预处理液与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，其中，所述预处理液包括：Tris‑HCl、EDTA‑2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。使用本发明专利技术的方法配置的核酸检测反应液，能够直接进行qPCR，提高检测效率，缩短检测时间。

Pretreatment method, pretreatment solution, kit and application of virus nucleic acid detection

【技术实现步骤摘要】
病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途
本专利技术涉及病毒样本的核酸检测领域；特别地，涉及一种病毒样本预处理方法和预处理液，用于对DNA/RNA病毒进行预处理。
技术介绍
现行传统的病毒预处理液主要有两种方式：基于Hank's基质的预处理液和基于胍盐的预处理液。Hank's液是病毒运送的常见的平衡盐溶液（BalancedSaltSolution，BSS）。受各种因素的影响，Hank's液保存呼吸道病毒（如流感病毒、新冠病毒等）只能保存数个小时，数个小时之后病毒形态就会受到影响，进而会影响到病毒的核酸检测效率，如果时间再延长一些，那么还很容易滋生细菌、真菌，导致Hank's液pH值下降，加速病毒降解，所以很难用于病毒的长期保存与核酸检测。而基于胍盐的病毒预处理液中的盐酸胍或者Rnasin的浓度相对而言较高（3-5M），高浓度的胍盐适用于常温下的病毒灭活。但是由于胍盐浓度太高，对于诸如磁珠法的核酸提取或纯化有很大的抑制作用，需要多次洗涤或者用于离心柱的方式才可进行。样本免提取的核酸释放及扩增技术（ExtractionFreeNucleicAcidReleaseandAmplificationTechnology，EFNART）,简称“一步法”技术，是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。这样的“一步法”操作将大大节省病毒核酸检测尤其是RNA病毒的检测时间，预计相比较传统的核酸提取后的扩增方法，该专利技术可以节省60%以上的时间，检测效率提升50%。在发生重大疫情（例如，2019-2020年发生的新冠2019-nCoV疫情）的时候，更加倾向于一步法检测，可以节省检测时间，提高效率，会对整个疫情的攻克带来巨大的贡献。但是，现行常见的病毒预处理液，例如Hank's和基于胍盐的预处理液均不能很好的用于后续的一步法检测，从而很难用于病毒样本的快速检测和筛查的应用场景中。因此，本领域需求一种能够很好适配于基于一步法的病毒核酸检测的样本预处理液。
技术实现思路
有鉴于此，第一方面，本专利技术提供一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。在本专利技术中，Tris-HCl可以约10~约200mM的浓度存在，优选以约80~约120mM的浓度存在，最优选以约100mM的浓度存在。在本专利技术中，EDTA-2Na可以约8~约50mM的浓度存在，优选以约10~约15mM的浓度存在，最优选以约10mM的浓度存在。在本专利技术中，氯化钠可以约0.5%~约2%（w/v）的浓度存在，优选以约0.8~约1%（w/v）的浓度存在，最优选以约0.9%（w/v）的浓度存在。在本专利技术中，“核糖核酸酶抑制剂”是指能够对核糖核酸酶进行抑制，使其失活的化学物质。包括但不限于焦碳酸二乙酯（DEPC）、RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物、SDS等。在本专利技术中，核糖核酸酶抑制剂（RNase抑制剂）可以约2U/mL~约800U/mL的浓度存在，例如，为约40U/mL、约50U/mL、约100U/mL；优选地，以约10~约30U/mL的浓度存在；最优选地，以20U/mL的浓度存在。在本专利技术中，pH值的范围为6.5~8.0，优选为7.0~8.0，最优选为7.5。抗生素包括但不限于Proclin类抗生素（如Proclin300和Proclin950）和NaN3。例如，在使用Proclin300作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.01%（v/v）；又例如，在使用Proclin950作为抗生素的情况下，其浓度可以为约0.04%（v/v）；但本专利技术不限于此。在一个具体的实施方案中，所述预处理液为Tris-HCl的浓度为100mM、EDTA-2Na的浓度为10mM、氯化钠的浓度为0.9%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为20U/mL，Proclin950的浓度为0.04%（v/v）；并将上述预处理液调至pH值为7.5。如本文所使用的，“样本”是指可能含有病毒的样本。所述样本可来源于人或动物的血液、粪便、尿液、口腔上皮细胞、脱落细胞、口腔拭子、咽拭子等。本专利技术中提及的“预处理”是指对样本进行检测之前的处理，尤其指在对样本进行（基于一步法的）核酸检测前的处理。本专利技术中提及的“预处理液”是指对病毒样本进行预处理的液体。在本专利技术中，病毒可为DNA病毒或RNA病毒。在一个优选地实施方案中，所述病毒为RNA病毒。在更优选地实施方案中，所述病毒为冠状病毒（如2019新型冠状病毒）、呼吸道合胞病毒、肠道病毒。使用本专利技术的预处理方法配置的核酸检测反应液，能够直接进行qPCR，无需提取或纯化过程，提高检测效率，缩短检测时间。该专利技术中采用的抗生素和核糖核酸酶抑制剂可以用于DNA病毒和RNA病毒的预处理，可以避免在常温状态下因为细菌等多种微生物的生长影响病毒保存的活性。RNA病毒由于随处可在的RNA酶的原因，更容易降解，使用本专利技术的方法同时避免医学采样过程中（口腔上皮细胞、脱落细胞、咽拭子等多种样本类型）由于样本本身或者采样耗材本身带来的对RNA的破坏，非常有利于RNA病毒的长期保存和检测。需要说明的是，在本专利技术的预处理液处理的样品不进行存放而是直接（即处理后0hr）进行EFNART检测的情况下，如下文实施例中所证实的，本专利技术预处理液的组分具有增强RT-PCT的作用。在第二方面，本专利技术提供了一种对样本中病毒核酸进行检测的方法，包括使用前述方法配置的反应液直接进行qPCR扩增而检测。样本释放剂是指能够释放样本中核酸的化学试剂。例如强酸性或强碱性的化学试剂。示例性的样本释放剂可以是包括0.01~0.5mmol/L莎梵婷（surfactin）、100~200mmol/L氯化钾、50~200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1%~1%十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%~1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为0.01%~2%十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05%~1%乙醇等组分中的一种或几种，但本专利技术不限于此。qPCR扩增试剂是指用于实时荧光定量核酸扩增检测的试剂。本领域技术人员能够理解qPCR扩增试剂通常含有DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液等。例如当检测对象为RNA时，还可进一步包括逆转录酶。不难理解，本领域技术人员可以根据具体需要（例如病毒的种类，含量等），确定PCR反应试剂的成分和浓度。本专利技术中提及的“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术（ExtractionFreeNucleicAcidReleaseandAmplificationTechnology,EFNART）。其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，/n其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；/n其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于病毒核酸检测的预处理方法，所述方法包括将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂和qPCR扩增试剂混合，
其中，所述预处理液包括：Tris-HCl、EDTA-2Na、氯化钠、核糖核酸酶抑制剂和抗生素；
其中，所述预处理液的pH为6.5~8.0。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为10~200mM，EDTA-2Na的浓度为8~50mM，氯化钠的浓度为0.5%~2%（w/v），核糖核酸酶抑制剂的浓度为2U/mL~800U/mL，并且抗生素的浓度为0.005~0.05%。


3.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述预处理液中，Tris-HCl的浓度为80~120mM、EDTA-2Na的浓度为10~15mM、氯化钠的浓度为0.8~1%（w/v）、核糖核酸酶抑制剂的浓度为10~30U/mL。


4.根据权利要求1所述的方法，其中，该方法所制备的反应液可直接进行qPCR扩增检测。


5.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，所述病毒为DNA病毒和RNA病毒，优选为RNA病毒，更优选为冠状病毒，如2019新型冠状病毒。


6.一种用于病毒核酸检测的预处理液，所述预处理液包括：Tris-HCl、...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴立忠，纪博知，范旭，谭德勇，邓中平，刘佳，
申请(专利权)人：圣湘生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43