一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法和检测方法技术

一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法和检测方法。检测文库构建方法包括如下步骤：(1)囊胚期滋养层细胞分离；(2)全基因组扩增；(3)DNA片段化；(4)Ion Proton文库构建。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法和检测方法
本专利技术涉及胚胎植入前遗传学筛查
，具体涉及一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法和检测方法。
技术介绍
随着生殖医学与试管婴儿技术的迅猛发展，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)及其相关衍生技术已成为目前不孕症治疗最重要的手段。据估计，目前世界上不孕夫妇约6000～8000万对，中国不孕夫妇约1200～1500万对，2010年数据显示，世界上已有400余万试管婴儿诞生。据报道，美国2009年ART治疗14.62万个周期；在中国，仅2012年约有30万对夫妇选择辅助生殖技术进行不孕症治疗。总体来说，目前IVF-ET活胎分娩率在35％左右，很大一部分比例胚胎未着床或不能发育到期导致停育、流产，胚胎染色体异常占很大比例。2009年发布的《中国不孕不育现状调研报告》显示，全国不孕不育患者人数已超过5000万，而试管婴儿技术能够有效帮助不孕不育患者解决生育难题。试管婴儿技术是将卵子与精子取出后置于特定的培养液内培养、受精，受精卵在恒温孵箱中发育为胚胎后移植回母体子宫，最终发育成胎儿。试管婴儿技术作为有效的辅助生殖手段成为大多数不孕不育夫妇的重要选择，而挑选健康胚胎移植是成功妊娠的关键。但是，通过试管婴儿方法获得的胚胎有40-60％存在染色体异常，且随着孕妇年龄增大，胚胎染色体异常的风险越高，而染色体异常是导致妊娠失败和自然流产的主要原因，因此，对于植入前的胚胎进行遗传学筛查是至关重要的。据报道，50％～60％孕早期的自然流产由遗传缺陷造成，其中86％为胎儿染色体数目异常，6％为胎儿染色体结构异常。其中，大约60％的首胎流产是由胎儿染色体异常所致。染色体异常在首胎流产的妇女占7％，而已成功生育1胎以上，再次妊娠流产的妇女占50％以上。因此进行PGS可以减少流产的发生，提高一些患者助孕的成功率。胚胎植入前遗传学筛查(PGS)是指胚胎植入着床之前进行染色体数目和结构异常的检测，挑选正常的胚胎植入子宫，以期获得正常的妊娠，提高患者的临床妊娠率。中国专利申请CN104711362A公开了一种利用胚胎囊胚期细胞进行基因组扩增并结合高通量测序技术对植入前的胚胎进行染色体检测，从中筛选出染色体正常胚胎的方法，可以全面完整的分析胚胎基因组的遗传变异信息，从而指导植入前胚胎的选择，减少遗传性疾病，提高试管婴儿的成功率，所涉及的步骤包括：囊胚期滋养层细胞分离；全基因组扩增；DNA片段化；Proton文库构建、上机测序及测序数据分析。该专利技术利用发育到囊胚期的胚胎进行滋养层细胞分离检测，避免了卵裂期细胞分离对胚胎造成的伤害，获得细胞数量比卵裂期更多，提高了基因组扩增的成功率及扩增效果；囊胚期的胚胎经过自然淘汰过程，选择优质的囊胚期胚胎进行检测，更节约成本。但是该技术存在的问题是建库使用的DNA量较大，高达500ng，并且建库过程需要PCR扩增步骤，DNA片段化使用酶打断法，影响片段化DNA的回收效率，不但步骤繁琐、检测周期过长，而且带来碱基错误和片段不均一性问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种低样本起始量、步骤简化、无需PCR(PCR-free)的胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法和检测方法。根据第一方面，一种实施例中提供一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法，包括如下步骤：(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的胚胎中分离胚胎滋养层细胞；(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞进行全基因组扩增、纯化以及基因组DNA的定量分析；(3)DNA片段化：对步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA采用物理打断成主带为120-150bp小片段DNA；(4)Ion Proton文库构建：以50ng以上的物理打断的小片段DNA为起始量，通过末端修复、连接接头、缺口平移步骤得到可用于上机测序的检测文库，其中该文库构建步骤不采用PCR扩增。进一步地，上述步骤(1)中，在受精卵体外发育到第5天时，分离3-8个囊胚期滋养层细胞。进一步地，上述步骤(2)中的全基因组扩增的DNA满足DNA浓度不低于30ng/μL、总量在100ng以上、无明显降解、无肝素、无RNA污染再进行后续步骤。进一步地，上述步骤(3)中物理打断采用Covaris打断法。进一步地，上述步骤(4)中作为起始量的小片段DNA为100ng。进一步地，上述步骤(4)中末端修复的反应体系是：主带为120-150bp小片段DNA 100ng，10×多核苷酸激酶缓冲液10μL，10mM dNTP溶液2.5μL，T4DNA聚合酶1μL，Klenow片段0.1μL，T4多核苷酸激酶1μL，以及余量的水，总体积为100μL。进一步地，上述步骤(4)中接头是Ion Proton测序平台的接头序列，连接接头的反应体系是：末端修复的DNA 44μL，2×快速连接缓冲液50μL，1.25μM Ion P1接头1μL，1.25μM Ion XpressTM Barcode X 1μL，T4DNA连接酶4μL，总体积为100μL。进一步地，上述步骤(4)中缺口平移的反应体系是：连接接头的DNA 37.2μL，10×Pfx缓冲液5μL，各自10mM dNTP溶液5μL，50mM MgSO4 2μL，2.5U/μL Platinum Pfx DNA聚合酶0.8μL，总体积为50μL。根据第二方面，一种实施例中提供一种胚胎植入前遗传学筛查的检测方法，包括如下步骤：(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的胚胎中分离胚胎滋养层细胞；(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞进行全基因组扩增、纯化以及基因组DNA的定量分析；(3)DNA片段化：对步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA采用物理打断成主带为120-150bp小片段DNA；(4)Ion Proton文库构建：以50ng以上的物理打断的小片段DNA为起始量，通过末端修复、连接接头、缺口平移步骤得到可用于上机测序的检测文库，其中该文库构建步骤不采用PCR扩增；(5)上机测序和数据分析：上机测序以获得每个DNA片段的碱基序列，并对碱基序列进行分析以获得染色体变异信息。本专利技术的方法有效地解决了检测周期过长的问题，同时优化的建库流程，缩减了一些复杂步骤，简化了流程，无需PCR扩增，使结果更加准确。具体而言：第一，对于样本类型而言，针对目前国内外市场对胚胎进行活检的时期、使用单细胞全基因扩增，只需要3-8个囊胚期滋养层细胞即可实现；第二，对于测序文库构建的实现而言，基于常规建库路线进行优化，去掉切胶纯化等复杂步骤，同时去掉PCR步骤以避免指数扩增对基因拷贝数变异(CNV)带来的影响，使用物理打断法来提高片段化DNA的回收效率，从而简化了建库步骤，缩短检测周期并节省人力；第三，对于技术极限及验证而言，在Ion Proton测序平台上，进行了微量样本检测测试，样本用量低至50ng也能实现，所需分析数据低至2M Uni本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的胚胎中分离胚胎滋养层细胞；/n(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞进行全基因组扩增、纯化以及基因组DNA的定量分析；/n(3)DNA片段化：对步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA采用物理打断成主带为120-150bp小片段DNA；/n(4)Ion Proton文库构建：以50ng以上的物理打断的小片段DNA为起始量，通过末端修复、连接接头、缺口平移步骤得到可用于上机测序的检测文库，其中该文库构建步骤不采用PCR扩增。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】一种胚胎植入前遗传学筛查的检测文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)囊胚期滋养层细胞分离：从发育至囊胚期的胚胎中分离胚胎滋养层细胞；
(2)全基因组扩增：对分离出的胚胎滋养层细胞进行全基因组扩增、纯化以及基因组DNA的定量分析；
(3)DNA片段化：对步骤(2)中定量分析合格的基因组DNA采用物理打断成主带为120-150bp小片段DNA；
(4)Ion Proton文库构建：以50ng以上的物理打断的小片段DNA为起始量，通过末端修复、连接接头、缺口平移步骤得到可用于上机测序的检测文库，其中该文库构建步骤不采用PCR扩增。


根据权利要求1所述的检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，在受精卵体外发育到第5天时，分离3-8个囊胚期滋养层细胞。


根据权利要求1所述的检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中的全基因组扩增的DNA满足DNA浓度不低于30ng/μL、总量在100ng以上、无明显降解、无肝素、无RNA污染再进行后续步骤。


根据权利要求1所述的检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中物理打断采用Covaris打断法。


根据权利要求1所述的检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中作为起始量的小片段DNA为100ng。


根据权利要求1所述的检测文库构建方法，其特征在于，所述步骤(4)中末端修复的反应体系是：主带为120-150bp小片段DNA 100ng，10×多核苷酸激酶缓冲液10μL，10mM dNTP溶液2.5μL，T4 DNA聚合酶1μL，Klenow片段0.1μL，...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈川，陈建国，杨传春，张瑜巨，庄丽雯，张文勇，
申请(专利权)人：深圳乐土生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44