用于稳定无细胞核酸和细胞的方法和组合物技术

本发明专利技术涉及用作稳定剂的组合物和用于稳定生物样品、特别是全血的方法，特别地涉及用于稳定无细胞核酸的含量和完整性的方法。在水溶液中，该组合物具有以下组分或由以下组分组成：至少一种缓冲至pH值为7或以下、优选地3.5至7.0的缓冲物质，至少一种用于二价阳离子的螯合剂和乌洛托品，任选地PEG。

Methods and compositions for stabilizing acellular nucleic acids and cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于稳定无细胞核酸和细胞的方法和组合物本专利技术涉及用于稳定无细胞核酸、特别是无细胞的DNA和/或RNA的方法和组合物，以及替代地或另外地，用于稳定来自生物样品、特别是全血或血浆或尿液的细胞的方法和组合物，和该组合物作为用于生物样品中的无细胞核酸和/或细胞的稳定剂的用途。可例如通过血液采集管将组合物与无细胞样品或含细胞样品混合，在所述血液采集管中已经直接地抽入了全血并且在其中存在所述组合物，例如以高达血液采集管为其设定的血液的最大体积的20％存在。对于尿液作为生物样品，可将组合物放置在样品容器中或与注入在其中的样品混合，其中在各自的情况下优选的是，将组合物以预定的体积比添加或混合至样品或者添加或混合以达到预定的样品体积。所述方法和组合物具有如下的优点：稳定生物样品中所含的无细胞核酸，特别是用于进一步分析，例如通过杂交、测序或扩增，任选地利用在先分离，例如通过吸附在用于核酸的吸附剂上并随后洗脱。无细胞核酸的稳定化特别地为无细胞核酸的数量和结构的保持，这也可称为其完整性。所述组合物和方法优选地还具有如下的作用(效果)：稳定样品中所含细胞，例如防止自发裂解，从而一方面，细胞中所含的核酸不会被释放到采样样品中或者在较小程度上被释放到采样样品中，并且不与样品中的无细胞核酸混合，以及另一方面，细胞可从样品中分离，以能够在基本上不受裂解的干扰，并且例如不含无细胞核酸的情况下对细胞进行分析。在此，细胞可为样品的供体的细胞，即人体自身的细胞，例如上皮细胞和/或肿瘤细胞，并且细胞可为外来细胞，例如细菌、真菌或酵母或病毒。从组合物与生物样品的混合物中分离出的细胞的分析可包括细胞内和/或表面结合的蛋白质的分析，例如通过免疫学分析。该组合物优选地导致表面结合的蛋白质在细胞上的稳定化。现有技术WO2013/123030A2描述了为稳定化全血以用于随后对无细胞DNA的分析而混入释放甲醛的化合物，特别是重氮烷基脲或咪唑烷基脲，其中结合了用于除去游离的甲醛的清除剂，例如氨基酸、特别是甘氨酸、烷基胺、多胺，在各自的情况下结合了作为阻凝剂的EDTA。Umetani等人，ClinicalChemistry52：6，1062-1069(2006)描述了通过定量PCR扩增ALU重复序列的两个区段(其中115bp(ALU115)的一个区段位于247bp(ALU247)的另一区段之内)来分析血清中的无细胞DNA的稳定性。扩增子(扩增产物)的量的比例形成DNA质量的量度。为1的ALU247/ALU115的PCR扩增子的商，即等量的ALU247和ALU115被认为是gDNA的特征，因为这样的样品除了小模板之外还包含更长的模板。对于无细胞(cf)DNA，Hao,T.B.,Shi,W.,Shen,X.J.,Qi,J.,Wu,X.H.,Wu,Y.,Tang,Y.Y.,Ju,S.Q.“Circulatingcell-freeDNAinSerumasabiomarkerfordiagnosisandprognosticpredictionofcolorectalcancer”,BritishJournalofCancer111,1482–1489(2014)给出的ALU247/ALU115商为约0.3。为了稳定全血，WO2013/045458描述了用于稳定全血的以下的混合物：作为高渗添加剂(hypertonischenZusatz)的二羟基丙酮，作为细胞外核酸稳定剂的N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二乙基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺或N,N-二乙基乙酰胺(N,N-Diethylacetatmid)，作为阻凝剂的螯合剂，和细胞凋亡抑制剂、特别地为半胱天冬酶抑制剂。WO2007/073397A1描述了一种用于治疗膀胱疾病的药物组合物，其具有在缓冲剂中的麻醉剂和阴离子多糖，其可包含六亚甲基四胺(对应于乌洛托品)作为抗菌剂。技术问题本专利技术的目的是提供用于稳定生物样品、特别是全血或尿液中的无细胞核酸例如DNA或细胞以用于后续分析的替代组合物和替代方法，其中所述组合物优选地是储存稳定的，并且更优选具有比已知试剂更低数量的各种成分。
技术实现思路
本专利技术通过权利要求的特征，特别是通过组合物用作稳定剂的用途以及用于稳定生物样品、特别是全血或尿液，特别是用于稳定无细胞核酸的含量和完整性和/或用于稳定细胞的含量和完整性的方法来实现所述目的。在水溶液中，该组合物具有以下或由以下组成：至少一种缓冲物质，其缓冲至pH值为7或以下、优选地3.5至7.0并且特别地被设定成将组合物和生物样品的混合物缓冲至此pH值；至少一种抗凝剂和/或至少一种螯合剂、特别是至少一种用于二价阳离子、优选地用于钙离子的螯合剂；和乌洛托品；任选地PEG，所述组合物特别地用作用于全血的稳定剂。由于螯合剂、特别是EDTA也是抗凝剂，因此出于本专利技术的目的，可通过螯合剂形成抗凝剂。为了用作用于作为生物样品的尿液的稳定剂，该组合物可具有以下或由以下组成：缓冲物质和乌洛托品，作为干燥的混合物，例如以粉末的形式，或者优选地以水溶液形式，任选地具有至少一种抗凝剂和/或螯合剂。通常，生物样品优选地为动物或人的组织或体液的样品。所述至少一种缓冲物质可选自以下或由以下组成：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、MES(2-N-吗啉代乙醇磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双-2-乙醇磺酸)、MOPS(3-N-吗啉代丙烷磺酸)、磷酸盐缓冲剂和其中至少两种的混合物。至少一种抗凝剂可为例如水蛭素，任选地以与螯合剂混合的形式。抗凝剂优选地为螯合剂，其例如可选自以下或由以下组成：柠檬酸盐和EDTA及其混合物。例如，当组合物包含柠檬酸盐时，可不向该组合物添加作为用于游离的或溶解在水中的甲醛的清除剂的化合物，该组合物特别地可以没有甘氨酸和/或没有另外的螯合剂，特别地没有EDTA(乙二胺四乙酸盐)。该组合物特别优选地由柠檬酸盐缓冲剂和乌洛托品在水中的溶液组成。为了用作用于无细胞核酸和/或用于尿液中的细胞的稳定剂，或在用于稳定无细胞核酸和/或尿液中细胞的方法中使用，组合物可由柠檬酸盐缓冲剂和乌洛托品，任选地连同抗凝剂和/或螯合剂，以干燥的混合物的形式组成，其中柠檬酸盐缓冲剂被设成，在样品中缓冲至pH值为7或以下、优选地3.5-7.0，特别是对于预定的样品体积。缓冲物质优选地具有柠檬酸盐缓冲溶液的缓冲容量，其具有在0.3至1M、优选地0.4至0.7M的范围内，例如0.5M的浓度，和在3.5至7、优选地4至6.5的范围内，对于全血作为样本的情况，例如pH4至4.5，通常更优选地4.5或4.2的pH值，并且例如被设定成，将生物样品和组合物的混合物缓冲至此pH。在缓冲溶液中，乌洛托品(六亚甲基四胺)的含量优选地在1至30重量/体积％的范围内、优选地在2或5至25重量/体积％或至20重量/体积％的范围内，例如5至19或至8重量/体积％。优选地，缓冲物质是浓度在0.3至1M、优选地0.4至0.7M的范围内，例如为0.5M的柠檬酸盐缓冲溶液，并且具有在3.5至7的范围内的pH值、优选地pH4至6.0，对于全血作为样本的情况，例如pH4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物作为用于生物样品中包含的无细胞核酸的稳定剂的用途，其特征在于，在水溶液中，该组合物具有至少一种缓冲物质、至少一种抗凝剂和乌洛托品、任选地PEG，所述缓冲物质缓冲至pH值为7或以下，所述抗凝剂优选地为螯合剂。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170802 EP 17184585.21.组合物作为用于生物样品中包含的无细胞核酸的稳定剂的用途，其特征在于，在水溶液中，该组合物具有至少一种缓冲物质、至少一种抗凝剂和乌洛托品、任选地PEG，所述缓冲物质缓冲至pH值为7或以下，所述抗凝剂优选地为螯合剂。


2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，在水溶液中，所述组合物由所述至少一种缓冲物质、所述至少一种抗凝剂和乌洛托品、任选地PEG组成，所述抗凝剂为螯合剂。


3.组合物作为用于生物样品中包含的无细胞核酸的稳定剂的用途，其特征在于，作为干混合物，所述组合物具有至少一种缓冲物质、至少一种抗凝剂和乌洛托品、任选地PEG，所述缓冲物质被设定成将所述生物样品缓冲至pH值为7或以下，所述抗凝剂优选地为螯合剂。


4.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述组合物不包含用于游离的或溶解的甲醛的清除剂化合物。


5.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述至少一种缓冲物质将所述水溶液缓冲至在3.5至7的范围内的pH值，并具有对应于0.3至1M的柠檬酸盐浓度的缓冲容量，并且1至30重量/体积％的乌洛托品溶解在所述溶液中。


6.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述至少一种缓冲物质和所述至少一种作为螯合剂的抗凝剂由柠檬酸盐缓冲剂形成。


7.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述至少一种缓冲物质选自：柠檬酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、MES(2-N-吗啉代乙醇磺酸)、PIPES(哌嗪-N,N′-双-2-乙醇磺酸)、MOPS(3-N-吗啉代丙烷磺酸)、磷酸盐缓冲剂和其中至少两种的混合物，并且所述至少一种抗凝剂为螯合剂，其选自：柠檬酸盐和EDTA及其混合物。


8.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，作为用于无细胞核酸的稳定剂的用途包括随后对无细胞级分的分离和对无细胞级分中包含的核酸的分析。


9.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，作为用于生物样品中包含的细胞的稳定剂的用途包括随后对含细胞级分的分离和对其中包含的细胞的分析。


10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，对含细胞级分的细胞的分析包括对细胞中包含的核酸的分析和/或对与细胞表面结合的蛋白质的免疫学分析。


11.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述生物样品是全血，并且所述组合物以占血...

【专利技术属性】
技术研发人员：M坎珀，T基尼茨，
申请(专利权)人：萨斯特德特股份有限两合公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE