用于从全血中分离核酸的装置和方法制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于使来自全血的全部核酸、特别地RNA稳定化的组合物，以及一种方法，所述方法用于使来自全血的全部核酸稳定化以用于随后的分离以及同时用于使细胞分解，使得细胞核酸在与所述组合物接触时、特别地在抽血时的状态下可被释放并且在性质和浓度方面可保持稳定并且可随后被隔离。在此，该组合物的特征在于，它特别地防止在其被混入的全血中的RNA的降解和重新合成。通过使含水组合物和血液的混合物与吸附剂接触而进行的RNA的分离可直接地由含水组合物与血液的完全混合进行，即例如，在没有核酸从混合物中沉淀和分离的情况下，任选地在储存后进行，在所述储存期间将所述混合物例如从采血点运输到分析过程所在地。

Devices and methods for separating nucleic acids from whole blood

The present invention relates to compositions for stabilizing all nucleic acids from whole blood, especially RNA, and a method for stabilizing all nucleic acids from whole blood for subsequent separation and cell decomposition, so that cellular nucleic acids can be released in contact with the compositions, especially in the state of blood drawing, and in nature and concentration. Aspects can remain stable and can be subsequently isolated. Here, the composition is characterized by preventing, in particular, the degradation and resynthesis of RNA in the whole blood in which it is mixed. The separation of RNA by contacting aqueous compositions and mixtures of blood with adsorbents can be carried out directly by the complete mixing of aqueous compositions with blood, i.e., in the absence of nucleic acid precipitation and separation from the mixture, optionally after storage, during which the mixture is transported, for example, from the blood collection point to the location of the analysis process.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于从全血中分离核酸的装置和方法本专利技术涉及用于使来自生物样品、特别地来自全血的核酸、特别地RNA(包括细胞中所含的RNA)稳定化(优选地伴随随后分离核酸)的组合物的方法，以及用作血液采集管的装置，其包含适用于使全部核酸、特别地全部RNA稳定化并且适用于随后的分离的组合物。用于使来自生物样品、特别地全血的核酸稳定化的组合物、方法和可用于所述方法的包含所述组合物的血液采集管的特征在于，实现了全血中的核酸、特别地RNA的有效稳定化并且允许快速有效的分离方法(过程)。在此，稳定化包括全部核酸、特别地全部RNA(包括无细胞血浆中所含的核酸、特别地RNA，以及血液中存在的细胞所含的核酸、特别地RNA)。现有技术WO02/056030A2描述了一种用于稳定化样品中的RNA含量的容器，其具有预定的真空以抽吸预定的样品体积，其中在所述容器中提供用于抑制基因诱导和对抗核酸的酶促降解的试剂(Mittel)，特别地巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)和离液盐(离液序列高的盐)，特别地异硫氰酸胍或盐酸胍。WO00/09746A1描述了一种血液采集容器，其包含用于裂解(Lyse)细胞和稳定化核酸的溶液，该溶液具有胍盐、缓冲液、洗涤剂和还原剂，特别地DTT、β-巯基乙醇和TCEP(三(2-羧基乙基)膦)。其中还原剂、特别地β-巯基乙醇或DTT被认为是对于稳定化血清中的RNA是所必需的。WO2009/018034A1涉及通过添加非离子型洗涤剂来提高SDS在用于细胞的裂解缓冲液中的溶解度以及通过添加裂解缓冲液和随后添加十倍体积的提取缓冲液从动物组织中分离DNA的方法，所述裂解缓冲液由以下组成：2MNaCl、1.2％SDS、12mMEDTA、24mMTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，pH8.0，含2％吐温(Tween聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯)，所述提取缓冲液由以下组成：50mMTris-HCl、pH7、10mMEDTA、7M盐酸胍、5％吐温20。WO2007/060248A1涉及用离液盐裂解细胞，即肝组织和随后添加非离液盐以将核酸结合到载体材料上。DE10147439A1描述了为了从血液中分离DNA而加入裂解试剂，然后通过离心分离含DNA的细胞组分。沉淀的DNA通过用盐酸胍重新悬浮并除去杂质例如蛋白质来纯化并通过加入酒精而沉淀并分离。DE102014220090B3描述了用于收集含有核酸的生物样品的容器，可向其中引入咽拭子(Abstrichtupfer)，其中该容器包含裂解液。CN104673623A根据针对带有盖子的样品容器的英文摘要描述了用于使血细胞核酸和无细胞DNA稳定化的组合物。专利技术目的本专利技术的目的在于，提供用于使全血中的全部核酸稳定化并且之后从全血中分离的替代组合物和优选地替代方法。优选地，组合物应使全血中的RNA稳定化并允许用于分离全部核酸、特别地RNA的快速方法。更优选地，该组合物应允许对可变的血液体积(血容量、血量)进行核酸的稳定化，使得包含该组合物的血液采集管不必被配置成吸入预定的血液体积。
技术实现思路
本专利技术利用权利要求的特征，特别地通过使全血中的全部核酸、特别地RNA稳定化的组合物，和用于使全血中的全部核酸稳定化以便随后分离的方法来实现上述目的，所述方法同时用于细胞的分解(或称为解体或崩解(Aufschluss))，使得当与所述组合物接触时，特别地在采血时，细胞核酸被释放并且可以在性质和浓度方面稳定地保存，然后被分离。在此，所述组合物的特征在于，它特别地防止在其被混入的全血中的RNA的分解和重新合成。相应地，本专利技术涉及所述组合物，优选地包含在血液采集管中的组合物用于所述方法的用途，特别地用作用于稳定化和分离血液中全部RNA的手段(试剂)，而不需要在将RNA吸附到吸附剂之前的沉淀和分离RNA的步骤。为了进行分离，可以使血液和含水(水性)组合物的混合物在不沉淀RNA的前提下与吸附剂接触。通过使含水组合物和血液的混合物与吸附剂接触而进行的RNA的分离可直接地由含水组合物与血液的完全(充分)混合进行，即例如，在没有核酸从混合物中沉淀和分离的情况下进行，任选地在储存后进行，在所述储存期间将所述混合物例如从采血点运输到分析过程所在地。生物样品优选地是液体并且任选地包含人或动物细胞。生物样品例如可为体液，例如脑脊液、尿液、痰液，含有单独或均质细胞的活体组织切片和特别地全血(也称为血液)。本说明书涉及全血作为生物样品的代表。组合物以水溶液的形式具有或由以下组成：至少一种胍盐，优选地硫氰酸胍；至少一种缓冲剂物质，优选地2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)；非离子型洗涤剂，优选地TritonX-100；和用于二价阳离子的络合剂，优选地乙二胺四乙酸(EDTA)；并且特别地不含还原剂，例如不含硫醇化合物或其前体化合物，特别地不含β-巯基乙醇和二硫苏糖醇(DTT)。以水溶液的形式，所述组合物具有或由以下组成：至少一种胍盐，例如达1.8至2.6M、优选地2.0至2.4M、更优选地2.2M；至少一种缓冲剂物质，以将血液体积缓冲为5.0至8.0的pH值，例如pH5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0至7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、优选地pH6.5至7.3的浓度，例如至少50mM、优选地至少70mM、例如最高达100mM或最高达74mM的MES；非离子型洗涤剂，例如TritonX-100，达10至20％(重量/体积)、优选地12至18％(重量/体积)；例如500至100mM、优选地70至80mM、更优选地约72mM的用于二价阳离子的络合剂、特别地EDTA，例如用于达到如下的血液体积与含水组合物的体积的比例：1:13或1:3或高达1:2、优选地高达1:2.6或高达1:2.5或1:2.4。优选地，本专利技术涉及所述组合物如下的用途：用作用于生物样品、特别地全血中所包含的细胞的分解剂，用作用于生物样品的全部核酸的稳定剂并用于通过将核酸从生物样品与该组合物的混合物吸附到核酸吸附剂上来进行分离，其中所述组合物以水溶液的形式包含或由以下组成：a.至少一种胍盐，b.至少一种缓冲剂物质，其用于缓冲至pH5.0-8.0，c.至少一种非离子型洗涤剂和d.至少一种用于二价阳离子的络合剂并且是e.不含还原剂的。优选地，所述组合物由以下的水溶液组成：a.至少一种胍盐，b.至少一种缓冲剂物质，c.至少一种非离子型洗涤剂和d.至少一种络合剂和任选地蛋白酶和/或DNA酶。所述组合物可用作用于全血中所包含的细胞的分解剂，并可用作用于其中所包含的全部核酸的稳定剂以及可用于通过将核酸直接从生物样品与该组合物的混合物吸附到用于核酸的吸附剂上来进行分离。缓冲剂物质例如选自：三(三(羟甲基)氨基甲烷)、柠檬酸盐或二水合磷酸盐(磷酸氢二钠)或二水合磷酸盐(磷酸氢钠)、BisTris-缓冲液(双(2-羟甲基)-亚氨基-三-(羟甲基)-甲烷)、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基甲磺酸)、碳酸氢钠、优选地2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。非离子型洗涤剂例如选自：吐温20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)、NonidetP40(4-壬基苯酚-聚乙二醇)、吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、Brij58(聚乙二醇十六烷基醚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物用作用于全血中包含的细胞的分解剂、用作用于全血的全部RNA的稳定剂以及用于通过将RNA从全血与所述组合物的混合物吸附到用于核酸的吸附剂上来进行分离的用途，其特征在于，所述组合物以水溶液的形式由：a.至少一种胍盐，b.至少一种缓冲剂物质，其用于缓冲至pH5.0‑8.0，c.至少一种非离子型洗涤剂和d.至少一种二价阳离子的络合剂e.和任选地蛋白酶和/或DNA酶组成，并且是f.不含还原剂的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.02.11 EP 16155286.41.组合物用作用于全血中包含的细胞的分解剂、用作用于全血的全部RNA的稳定剂以及用于通过将RNA从全血与所述组合物的混合物吸附到用于核酸的吸附剂上来进行分离的用途，其特征在于，所述组合物以水溶液的形式由：a.至少一种胍盐，b.至少一种缓冲剂物质，其用于缓冲至pH5.0-8.0，c.至少一种非离子型洗涤剂和d.至少一种二价阳离子的络合剂e.和任选地蛋白酶和/或DNA酶组成，并且是f.不含还原剂的。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述胍盐为硫氰酸胍，所述缓冲剂物质为2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、柠檬酸盐、(磷酸氢二钠)二水合磷酸盐、BisTris-缓冲液(双(2-羟甲基)-亚氨基-三-(羟甲基)-甲烷)、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基甲磺酸)、碳酸氢钠或(磷酸氢钠)二水合磷酸盐，所述非离子型洗涤剂为TritonX-100、吐温20、吐温80(聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)、Brij58(聚乙二醇十六烷基醚)、TritonX-114(辛基苯酚聚乙二醇醚)或NonidetP40，并且所述络合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，并且它不含硫醇化合物或其前体化合物作为还原剂。3.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述用途包括通过使由全血和所述组合物组成的混合物与用于核酸的吸附剂接触而从所述混合物中分离核酸，而不用预先通过离心所述混合物来沉淀和分离核酸。4.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，在混合物中以最高达1:13的全血与所述组合物的可变体积比提供所述组合物。5.根据前述权利要求之一所述的用途，其特征在于，所述组合物包含在血液采集管中。6.血液采集管的根据权利要求5中所述的用途，其特征在于，所述血液采集管被配置成吸入可变体积的生物样品。7.根据前述权利要求之一中所述的用作用于全血中包含的细胞的分解剂、用作用于全血中包含的全部RNA的稳定剂以及用于通过将核酸直...

【专利技术属性】
技术研发人员：R舒斯特，
申请(专利权)人：萨斯特德特股份有限两合公司，
类型：发明
国别省市：德国,DE