提高基因组序列修饰技术中的突变导入效率的方法、及其使用的分子复合体技术

本发明专利技术提供修饰双链DNA的靶向位点的方法，所述方法包括以下步骤：通过将与该双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与PmCDA1键合而成的复合体，导入具有该双链DNA的细胞，并将该细胞至少暂时地在低温下培养，从而使该靶向位点，即靶核苷酸序列及其附近的核苷酸发生缺失或转换为其它核苷酸、或向该部位插入核苷酸的步骤。

Methods for Improving Mutation Transfer Efficiency in Genome Sequence Modification Technology and Molecular Complexes Used

The present invention provides a method for modifying a targeting site of double-stranded DNA. The method comprises the following steps: introducing a cell with the double-stranded DNA into a complex formed by binding a nucleic acid sequence recognition module specifically bound to the target nucleotide sequence in the double-stranded DNA with PmCDA1, and culturing the cell at least temporarily at low temperature, so as to make the targeting site, i.e. target nucleotide sequence. The steps by which a column and its adjacent nucleotides are deleted or converted to other nucleotides or inserted into the site.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】提高基因组序列修饰技术中的突变导入效率的方法、及其使用的分子复合体
本专利技术涉及提高基因组序列修饰技术的突变导入效率的方法、及其使用的核酸序列识别模块与核酸碱基转化酶与碱基切除修复抑制剂(baseexcisionrepairinhibitor)的复合体，所述方法能够不伴随DNA的双链切割(无切割或切割一条链)、也不进行外来DNA片段的插入，而进行基因组的特定区域内的核酸碱基修饰。
技术介绍
近年来，作为在各种生物种类中修饰靶基因、基因组区域的技术，基因组编辑受到瞩目。目前，作为基因组编辑的方法，提出了利用将具有序列非依赖的DNA切割能力的分子与具有序列识别能力的分子组合而成的人工核酸酶的方法(非专利文献1)。已有报告例如：使用由锌指DNA结合结构域与非特异性DNA切割结构域连接而成的锌指核酸酶(ZFN)，在作为宿主的植物细胞或昆虫细胞中，进行DNA中的靶基因座的重组的方法(专利文献1)；使用由作为植物病原菌黄单胞菌属具有的DNA结合模块的转录激活子样(TAL)效应子，与DNA核酸内切酶连接而成的TALEN，在特定的核苷酸序列内或其相邻位点进行切割、修饰靶基因的方法(专利文献2)；或者，利用由在真细菌和古细菌具有的获得性免疫系统中起作用的DNA序列CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)，和与CRISPR一起具有重要的作用的核酸酶Cas(CRISPR-相关的)蛋白家族组合而成的CRISPR-Cas9系统的方法(专利文献3)。进一步，也报告了使用由核酸酶与PPR蛋白质所连接而成的人工核酸酶，在该特定序列的附近切割靶基因的方法(专利文献4)，其中，PPR蛋白质为利用包括35个氨基酸并识别1个核酸碱基的PPR基序的连续，来识别特定的核苷酸序列的方式构建而成。但是，这些基因组编辑技术基本上是以DNA双链切割(double-strandedDNAbreaks:DSB)为前提的，由于会伴随意想不到的基因组修饰，因此存在强细胞毒性、染色体重排等副作用，存在诸如以下共通问题：在基因治疗中的可靠性受损、核苷酸修饰导致的细胞存活数极少、在灵长类卵细胞、单细胞微生物中基因修饰本身难以进行。另一方面，作为不伴随DSB而进行核苷酸修饰的方法，本专利技术人报告了在Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统中，通过使用催化脱氨基反应的脱氨酶并将其与具有DNA序列识别能力的分子连接，成功地不伴随DSB而进行了基于包含特定的DNA序列的区域中的核酸碱基转变的基因组序列的修饰(专利文献5)。根据该基因组编辑技术，由于没有外来DNA的插入也不伴随DNA双链切割，因此安全性优异，而且理论上可以将突变导入的范围广泛设定为从一个碱基的定点(pinpoint)至几百个碱基的范围。然而，与使用了具有正常的DNA切割能力的Cas9的基因组编辑技术相比，存在突变导入效率较低的问题。另外，尚没有报告在基因组编辑技术中，通过将细胞的培养温度转移至低温而提高突变导入效率的方法。进而，也没有报告作为脱氨酶的一种的源自七腮鳗的PmCDA1(Petromyzonmarinuscytosinedeaminase1)在比作为一般酶的最适温度的约37℃更低的情况下，其活性提高。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第4968498号公报专利文献2：日本特表2013-513389号公报专利文献3：日本特表2010-519929号公报专利文献4：日本特开2013-128413号公报专利文献5：国际公开第2015/133554号非专利文献非专利文献1:KelvinMEsvelt,HarrisHWang(2013)Genome-scaleengineeringforsystemsandsyntheticbiology,MolecularSystemsBiology9:641
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于提供一种提高突变导入效率的基因组编辑的方法、以及用于其的核酸序列识别模块与核酸碱基转化酶与碱基切除修复抑制剂的复合体，所述方法不切割双链DNA或者是通过单链切割而修饰基因的特定序列的核酸碱基。解决问题的方法本专利技术人在使用了核酸碱基转化酶的基因组编辑技术中，探寻了提高突变导入效率的方法的开发。在提高突变导入效率的方法的开发中，一般而言主要聚焦在通过对核酸碱基转化酶加以突变或置换为另外的酶从而提高核酸碱基转变能力的方法、提高核酸序列识别模块的核酸识别能力的方法等。本专利技术人转变了这些普遍的构思，推测在该基因组编辑技术中，作为突变导入效率较低的原因之一，是否在由核酸碱基转化酶转换了碱基的部位发生了基于DNA糖基化酶等碱基切除修复机制的作用，从而使得导入的错配将会被修复，并得到了这样的构想：是不是可以通过抑制碱基切除修复机制中发挥功能的蛋白质而提高突变导入效率。为此，本专利技术人共表达了抑制脱氨基碱基的修复的尿嘧啶DNA糖基化酶抑制剂(Ugi)，结果发现突变导入效率飞跃性提高了。另外，由于作为核酸碱基转化酶中的一种的PmCDA1源自作为变温动物的七腮鳗，因此推测PmCDA1的酶活性的最适温度是否低于作为普通酶的最适温度的约37℃，并得到了这样的构想：是不是可以通过调整培养温度而提高酶活性。为此，为了提高PmCDA1的酶活性而将导入了PmCDA1的细胞暂时地在低温下培养，结果发现突变导入效率提高了。本专利技术人基于这些见解进一步反复研究，结果完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]修饰双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤：通过将与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与PmCDA1键合而成的复合体，导入到具有该双链DNA的细胞并将该细胞至少暂时地(temporarily)在低温下培养，从而在该靶向位点中不切割该双链DNA中的至少一条链、而使该靶向位点中的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸、或向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。[2]根据[1]所述的方法，其中，上述Cas缺失双链DNA切割能力。[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，上述细胞为哺乳动物细胞。[4]根据[3]所述的方法，其中，低温为20℃至35℃。[5]根据[3]所述的方法，其中，低温为25℃。[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，双链DNA与复合体的接触，通过向具有该双链DNA的细胞中导入编码该复合体的核酸来进行。[7]修饰双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤：通过将与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与核酸碱基转化酶与碱基切除修复抑制剂键合而成的复合体，与该双链DNA进行接触，从而在该靶向位点中，不切割该双链DNA中的至少一条链、并使该靶向位点中的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸、或向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。[8]根据[7]所述的方法，其中，上述Cas的双链DNA切割能力有缺陷。[9]根据[7]或[8]所述的方法，其中，上述核酸碱基转本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.修饰双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤：通过将与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与PmCDA1键合而成的复合体，导入到具有该双链DNA的细胞并将该细胞至少暂时地在低温下培养，从而在该靶向位点中不切割该双链DNA中的至少一条链、并使该靶向位点中的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸、或向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR‑Cas系统。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.21 JP 2016-0856311.修饰双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤：通过将与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与PmCDA1键合而成的复合体，导入到具有该双链DNA的细胞并将该细胞至少暂时地在低温下培养，从而在该靶向位点中不切割该双链DNA中的至少一条链、并使该靶向位点中的1个以上的核苷酸缺失或转换为其它1个以上的核苷酸、或向该靶向位点插入1个以上的核苷酸的步骤，该核酸序列识别模块为Cas的至少1个DNA切割能力失活的CRISPR-Cas系统。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述Cas缺失双链DNA切割能力。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞为哺乳动物细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其中，低温为20℃至35℃。5.根据权利要求3所述的方法，其中，低温为25℃。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，双链DNA与复合体的接触，通过向具有所述双链DNA的细胞中导入编码所述复合体的核酸来进行。7.修饰双链DNA的靶向位点的方法，其包括以下步骤：通过将与选择的双链DNA中的靶核苷酸序列特异性结合的核酸序列识别模块与核酸碱基转化酶与碱基切除修复抑制剂键合而成的复合体，与该双链DNA进行接触，从而在该靶向位点中，不...

【专利技术属性】
技术研发人员：西田敬二，近藤昭彦，荒添贵之，岛谷善平，
申请(专利权)人：国立大学法人神户大学，
类型：发明
国别省市：日本,JP