一种全基因组分子标记检测的方法技术

本发明专利技术公开了一种全基因组分子标记检测的方法。本发明专利技术将传统的转座子显示技术与高通量测序技术相结合，简化了传统的转座子显示技术的实验流程，提高了实验结果的准确性。和传统的转座子显示技术不同，本发明专利技术利用Tn5转座酶复合体打断DNA，并在打断的DNA片段末端加上可以用来作为引物结合位点的DNA接头。本发明专利技术的方法操作简单，利用高通量测序技术替代聚丙烯酰胺凝胶电泳，不仅简化了实验流程，也提高了全基因组标记检测的准确性。结合高通量测序的barcoding技术，可以将不同样品的PCR扩增产物混合在一起进行测序，因此可以同时检测多个样本的分子标记信息，提高了分子标记检测的样本通量。

A Method for Detecting Genome-wide Molecular Markers

The invention discloses a method for genome-wide molecular marker detection. The invention combines the traditional transposon display technology with high throughput sequencing technology, simplifies the experimental flow of the traditional transposon display technology, and improves the accuracy of the experimental results. Unlike the traditional transposon display technology, the invention uses the Tn5 transposase complex to interrupt DNA, and adds a DNA junction at the end of the interrupted DNA fragment that can be used as a primer binding site. The method of the invention is simple in operation. Instead of polyacrylamide gel electrophoresis, high-throughput sequencing technology not only simplifies the experimental process, but also improves the accuracy of the whole genome marker detection. Combining with barcoding technology of high throughput sequencing, the amplified products of different samples can be mixed together for sequencing, so the molecular marker information of multiple samples can be detected simultaneously, and the sample throughput of molecular marker detection can be improved.

【技术实现步骤摘要】
一种全基因组分子标记检测的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用改进的转座子显示技术做全基因组分子标记检测的方法。
技术介绍
SNP(Single-nucleotidepolymorphism，单核苷酸多态性)标记是一种以DNA多态性为基础的遗传标记，它是DNA水平上遗传多态性的直接反映，广泛存在于基因组的各个区域，数量巨大，通过对随机分布于整个基因组的SNP标记的多态性进行比较，就能够全面评估研究对象的多样性，并揭示其遗传本质。目前，在科研、农业育种和临床检测等领域，常用的全基因组SNP标记检测的方法有芯片杂交、全基因组测序、简化基因组测序RAD(Restriction-siteassociatedDNAsequencing)或GBS(Genotyping-by-Sequencing)、目标区域捕获测序、rAmpseq(RepeatAmplificationSequencing)，多重PCR等。除芯片杂交外，这些方法的本质都是通过测序，找出不同个体中的DNA序列差异作为分子标记。芯片杂交是将基因组DNA与一组已知序列的DNA探针杂交，通过杂交信号区分不同的基因型；全基因组测序技术是对整个基因组测序，然后将测序结果与参考基因组序列比对，找出多态性位点，全基因组测序虽然可以鉴定出全基因组水平的所有多态性标记，标记的密度最高，但其成本也相对较高，在实际应用中，有时低密度的全基因组分子标记即可满足需要，在这种需求驱动下，简化基因组测序(RAD或GBS)应运而生。简化基因组测序是指通过一系列的分子生物学操作，只选择部分基因组(一般为1％-10％)测序而获得散布于全基因组的部分分子标记，用于代表全基因组的遗传多样性信息。目前常用的简化基因组测序方法有RAD，GBS，2bRAD，2dRAD等。目标序列捕获测序，是将感兴趣的基因组区域合成为带生物素的特异性DNA或RNA探针，与制备好的基因组DNA测序文库进行杂交(固相或液相)，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后进行测序，以获得目标区域的遗传信息，由于是定制探针，所以目标区域捕获测序的靶位点位置和数量可以灵活控制，但其成本也较高；rAmpseq测序是筛选基因组中的中度重复序列区域的一些保守序列设计引物，用少数几对引物扩增基因组中的包含这些引物序列的所有中度重复序列然后进行测序，获得分子标记信息。多重PCR也叫多重引物PCR，是在同一个PCR反应中加入多对引物，达到扩增多个目标片段的目的。转座子是基因组的重要组成成分，依据不同的转座机制可分为两大类：一类是RNA介导的转座子，这类转座子的复制和转座涉及逆转录过程，被称为反转录转座子；另一类是以DNA为介导，采用剪切—粘贴机制来完成自身转座，称为DNA转座子。MITE(miniatureinvertedrepeattransposableelement)类转座子属于DNA转座子，在基因组上广泛分布，具有拷贝数量多和高度保守的特点，且多分布在基因富集区域。这些特点使其很适合做全基因组分子标记。转座子显示(transposondisplay,TD)技术是利用高拷贝保守转座子在基因组中散布分布的特点，通过接头连接PCR对转座子附近的目标DNA区域进行扩增，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分不同长度的PCR产物，作为分子标记。上述芯片杂交、全基因组测序、简化基因组测序、目标区域捕获测序、rAmpseq，多重PCR等技术等方法存在着一些缺陷：1.芯片杂交：针对每一个物种都需要根据已知SNP序列信息设计探针，当这些信息缺失时就不能使用芯片杂交来做基因型检测，此外，虽然芯片杂交后期的成本低廉，但前期芯片的设计和制作成本昂贵，只有当样品数量大时才可以摊薄这一部分的成本，因此，芯片杂交不适用于不常研究物种和一些个性化的研究。2.全基因组重测序：需要对整个基因组进行测序，测序量大，成本高，有时并不需要全基因组的高密度标记，因此就会造成数据的浪费。3.简化基因组测序：文库制备的操作流程繁琐，涉及到酶切、接头连接、片段选择等。4.目标区域捕获测序：需要根据参考基因组序列设计探针，只适合已经有全基因组序列的物种；此外，探针合成的成本非常高，实验操作繁琐，探针杂交时需要在15μL左右的体系中60℃杂交16小时左右，稍有不慎，就会蒸干，整个实验流程的失败率高。5.rAmpseq：标记全部位于基因组重复区域，最终得到的序列有时无法确定是位于基因组不同位置的copy本身的多态性还是不同个体之间同样位置的copy之间的多态性，因此，这种方法得到的多态性标记准确度不高。6.传统的转座子显示技术：实验操作繁琐，PCR产物需要利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，通量低，得到的标记数量也少，实验过程中限制性内切酶酶切和PCR的效率会对标记的准确度产生影响。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用改进的转座子显示技术做全基因组分子标记检测的方法，克服传统分子标记方法成本高，操作过程繁琐，失败率高以及标记不准确等问题。一种全基因组分子标记检测的方法，包括如下步骤：(1)利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA，同时，Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物，在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处，作为后续PCR反应的引物结合位点；(2)Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物，所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分：不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段；第一轮PCR反应以T-primer1与TD-seq1为引物进行扩增；被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段，而不含目标转座子的DNA片段由于没有T-primer1引物结合位点，不会被扩增；经过第一轮PCR，包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集，PCR产物的一端为目标转座子，此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列，另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列；(3)在第二轮PCR扩增时，以第一轮PCR产物为模板，利用引物T-primer2和TD-seq2，进行PCR扩增，通过第二轮PCR扩增，目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列；(4)经过两轮PCR扩增，目标转座子附近的序列得到极大富集，对所富集的片段进行片段选择并进行高通量测序，得到的扩增片段中包含的SNP信息便反映基因组相应区域的DNA多态性。所述T-primer1的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。所述TD-seq1引物5’端为Amp7序列，中间为8bp的index序列，3’端碱基序列可退火结合在Tn5接头序列上。所述引物T-primer23’端碱基序列可以在T-primer1的左侧退火，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO：2所示。所述引物T-primer2的3’端碱基结合在T-primer1的IlluminaP5接头序列上，中间为8bp的index序列，5’端碱基序列为Amp5。所述TD-seq1包含Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列；所述P7端的接头序列包含barcode。本专利技术的有益效果：本专利技术将传统的转座子显示技术与高通量测序技本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种全基因组分子标记检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA，同时，Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物，在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处，作为后续PCR反应的引物结合位点；（2）Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物，所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分：不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段；第一轮PCR反应以T‑primer1与TD‑seq1为引物进行扩增；被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段，而不含目标转座子的DNA片段由于没有T‑primer1引物结合位点，不会被扩增；经过第一轮PCR，包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集，PCR产物的一端为目标转座子，此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列，另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列；（3）在第二轮PCR扩增时，以第一轮PCR产物为模板，利用引物T‑primer2和TD‑seq2，进行PCR扩增，通过第二轮PCR扩增，目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列；（4）经过两轮PCR扩增，目标转座子附近的序列得到极大富集，对所富集的片段进行片段选择并进行高通量测序，得到的扩增片段中包含的SNP信息便反映基因组相应区域的DNA多态性。...

【技术特征摘要】
1.一种全基因组分子标记检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）利用Tn5转座酶复合体随机打断水稻基因组DNA，同时，Tn5接头作为Tn5转座酶的反应底物，在Tn5切割DNA的同时被连接到断点处，作为后续PCR反应的引物结合位点；（2）Tn5转座酶复合体随机打断反应完成后将DNA产物，所有的DNA片段根据是否含有目标转座子分为两部分：不含目标转座子的片段和含有目标转座子的片段；第一轮PCR反应以T-primer1与TD-seq1为引物进行扩增；被扩增的片段都是含有目标转座子的DNA片段，而不含目标转座子的DNA片段由于没有T-primer1引物结合位点，不会被扩增；经过第一轮PCR，包含目标转座子的DNA片段通过PCR扩增被富集，PCR产物的一端为目标转座子，此端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5端的部分接头序列，另外一端是Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P7端的接头序列；（3）在第二轮PCR扩增时，以第一轮PCR产物为模板，利用引物T-primer2和TD-seq2，进行PCR扩增，通过第二轮PCR扩增，目的PCR产物片段的两端被加上Illumina测序平台进行DNA测序时所需要的P5和P7端的全部接头序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：常玉晓，王越，张翠翠，赵胜，汪泉，
申请(专利权)人：中国农业科学院深圳农业基因组研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44