测定全血样品中白细胞个数的方法技术

公开了一种测定全血样品中白细胞个数的方法，该方法包括：将全血样品与表面活性剂混合从而获得混合物；将混合物静置足够时间，以便溶解全血样品中所含的白细胞，并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；测量混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；基于释放出的髓过氧化物酶浓度测定全血样品中白细胞的个数。还公开了这样一种方法，其中除测量全血样品中白细胞的个数外，还测量同一全血样品中所含的Ｃ－反应性蛋白的浓度。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利
本申请涉及。具体来讲，本专利技术涉及，该方法包括将全血样品与表面活性剂混合得到混合物；使混合物静置足够时间以便溶解全血样品中所含的白细胞并从白细胞中释放出固有髓过氧化物酶；测量混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；并根据释放的髓过氧化物酶的浓度确定全血样品中白细胞的个数。通过本专利技术测定白细胞个数的方法，可容易而又快速地完成对全血样品中白细胞个数和/或嗜中性白细胞个数的确定，而无需从全血样品中分离血细胞。此外，通过本专利技术的测定方法，除可测定全血样品中白细胞的个数外还可测量同一全血样品中包含的C-反应性蛋白的浓度，从而能迅速、容易而又低成本地诊断感染性疾病的存在与不存在和炎症严重程度。现有技术近年来，在对患者进行诊断的初始步骤中，将测定全血样品中的白细胞个数和全血样品中所含的C-反应性蛋白的浓度(下文常简称为℃RP”)作为判断患者是否具有细菌性感染性疾病的检测项目。在这一点上，为使医生能够采取适当的措施例如抗生素给药，希望发展一项快速、简单而又廉价地产生结果的检测技术。通常，利用商业可得的全自动血细胞计数装置可实现对白细胞个数的测定，血细胞计数装置是基于孔隙阻抗方法，并以COULTERCOUNTERTM(由美国COULTER ELECTRONICS有限公司制造并销售)为代表。然而，不能利用该装置测定作为血浆蛋白CRP的浓度。近年来，有一种能测定白细胞个数和CRP浓度的装置打入市场，在Yasuo YAMAO，Hiroshi OKUNARI和Henri CHAMPEIXReadout，16，11-15(1998)中描述了该装置，在该装置中可根据乳液浊度免疫测定法赋予基于孔隙阻抗法的血细胞计数装置CRP测定功能。在利用该装置的情况下，其步骤如下首先溶解全血样品中的红细胞，然后，通过孔隙阻抗法测定白细胞个数，接着，通过以下方法实现CRP测定含有溶解的血细胞的全血样品与具有与之结合的抗-CRP抗体的乳液小球反应预定时间，然后由乳液浊度免疫测定法测定CRP浓度。即，在利用上述装置时，基于不同原理实现白细胞个数测定和CRP浓度测定，从而完成测定需要完全不同的操作。因此，利用上述装置的传统方法具有如下缺点需要非常麻烦的操作，测定使用若干试剂，由此导致成本增加。另外，装置的维护保养需要很多时间和较高费用。由于这些缺点，几乎在所有的医疗机构内还没有引入自动血细胞计数装置，这些医疗机构有提供初级保健的责任，例如执业医师、普通医院，因此，这不能完全满足医疗保健的需要。作为解决上述问题的手段，想得到一种基于同一原理测定白细胞个数和CRP浓度的方法。具体来讲，想得到这样一种方法针对一份全血样品，可通过免疫方法既测定白细胞个数又测定CRP浓度。通过测量白细胞中特有的蛋白质可实现白细胞个数的免疫测定。通常已知的是，当出现细菌感染或炎症时，血液中嗜中性白细胞的数量增加，嗜中性白细胞在所有类型的白细胞中占比率最高。因此，通过测定嗜中性白细胞的个数可检测到白细胞个数的增加与减少，从而可判断细菌感染性疾病的存在与不存在和炎症的严重程度。作为测量组织发炎处嗜中性白细胞个数或测量全血样品中白细胞个数或粒细胞个数的方法的例子，可提到在Peter P.Bradley，DennisA.Priebat，Robert D.Christensen and Gerald RothsteinJ.Invest.Dermatol.，78，206-209(1982)中描述的方法。该方法叙述如下。首先，通过利用Ficoll试剂将嗜中性白细胞从全血样品中分离出来，或获得受感染的皮肤组织。所获得的嗜中性白细胞或所获得的感染皮肤组织在含0.5％溴化十六烷基三甲铵(HTAB)的50mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.0)中进行均质化，然后进行超声波处理以提取髓过氧化物酶，接着测定所提取的髓过氧化物酶的酶活性。在Rita Cramer，、Maria Rosa Soranzo、Pietro Dri，RenzoMenegazzi、Anna Pitotti、Giuliano Zabucehi和PierluigiPatriarcaJournal of immunological Methods，70，119-125(1984)中公开了另一种方法。该方法叙述如下。将葡聚糖(Mw 200,000)作为抗凝血剂加到含ACD(acid citrate dextrose)溶液的血液中获得混合物。从所获得的混合物中去除红细胞。接着，往所得物中加入Ficoll试剂，并通过离心作用将粒细胞从所获混合物中分离出来。然后，将2×104个粒性白细胞与含13mM邻甲氧基苯酚和0.02％溴化十六烷基三甲铵的0.1M的磷酸盐缓冲溶液(pH7.0)混合。加入1μmol的H2O2，测量过氧化物酶的活性。W.M.Kuebler，、C.Abels、L.Schuerer和A.E.GoetzInt.J.Microcirc.，16，89-97(1996)公开了下面的方法。利用Ficoll试剂将多形核白细胞从全血中分离出来。用含0.5％HTAB的50mM磷酸钾缓冲溶液(PH6.0)溶解所得的白细胞，然后测定所得细胞溶解混合物中的髓过氧化物酶的酶活性。此外，上述现有技术的文献中也公开了这样一种方法，在该方法中将大鼠脑组织或家兔肺组织在1ml的0.02M磷酸钾缓冲溶液(PH7.4)中均质化，用冰块对其进行冷却，然后加入1ml的0.02M磷酸钾缓冲溶液(PH7.4)，在4℃下以2000rpm将所得产物离心15分钟，获得含上清液的离心产物。接着，测定上清液中髓过氧化物酶的酶活性。此外，在60℃下将离心产物的剩余物培养2小时，然后用50mM含0.5％HTAB的磷酸钾缓冲溶液(PH6.0)将其均质化，然后经超声处理，在4℃下以20000rpm将反应产物离心15分钟以获得上清液。接着，测定上清液中髓过氧化物酶的酶活性。国际申请公开第WO93/01306号公开了下面的方法。将预定量的血液置于冲洗器内放置的玻璃微纤维过滤器上。向血液内加水，使红细胞溶解而不会破坏粒性白细胞，通过压力冲洗去除血液中的细胞溶解成分，以去除妨碍粒性白细胞个数测定的成分并获得玻璃微纤维过滤器上承载的不溶粒性白细胞。干燥载有不溶粒性白细胞的玻璃微纤维过滤器，将50mM磷酸盐缓冲溶液滴加到玻璃微纤维过滤器上，该缓冲溶液含0.005％的TritonTMX-100、30mM 3-氨基-1，2，4-三唑、0.0005％的H2O2和0.5mg/ml的邻联甲苯胺，从而从粒性白细胞中释放出髓过氧化物酶，并通过染色形成蓝色斑点。对表示粒性白细胞的蓝色斑点进行计数。日本专利申请特许公开说明书第8-308593号(对应于EP 743519和US专利第5639630号)公开了下面的方法。准备一种溶液，该溶液含有非离子多乙氧基化表面活性剂、阴离子表面活性剂或两性表面活性剂，其浓度可溶解全血中的红细胞，从而从红细胞中释放出血红蛋白，但它不会破坏白细胞；甲醛或多聚甲醛，它的浓度可使其与白细胞进行化学交联但不会与红细胞交联；糖或糖醇，它们能增强淋巴细胞的可检测性；以及缓冲溶液，其能使反应混合物的pH值位于中性点或中性点附近，具体来讲，pH范围从约6.8到约8.0。将该溶液与全血混合，将所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定全血样品中白细胞个数的方法，它包括： （ａ）将全血样品与表面活性剂混合，从而获得混合物； （ｂ）使所述混合物静置足够时间，以便溶解所述全血样品中所含的白细胞，并从所述白细胞中释放出固有髓过氧化物酶； （ｃ）测量所述混合物中释放出的髓过氧化物酶的浓度；以及 （ｄ）基于所述释放出的髓过氧化物酶浓度测定所述全血样品中白细胞的个数。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：畑中美博，芹泽领，
申请(专利权)人：旭化成株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]