一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法技术

本发明专利技术提供一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法。所述短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法包括以下步骤：S1：建立基于AFM的微纳加工系统；S2：利用微纳加工系统和机械‑化学相结合的方法制作可控自组装芳香烃单层膜；S3：将DNA探针固定在所述芳香烃偶连层修饰的硅表面；S4：对DNA进行检测和表征。本发明专利技术提供的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法具有利用微纳制造技术中的机械‑化学方法来实现硅表面可控自组装单链DNA的制备，解决目前DNA探针制备存在的尺寸、位置和形状都不可控的问题的优点。

A method of DNA probe immobilization on silicon substrate mediated by short chain aromatic molecules

【技术实现步骤摘要】
一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法
本专利技术涉及建筑
，尤其涉及一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法。
技术介绍
由于基因组及后基因组计划的开展，近年来基于杂交特异性而发展起来的DNA识别技术得到了迅速的发展，DNA检测和识别技术将大量DNA探针以一定的阵列固定在表面上，通过一次实验即可得出大量的序列信息，在基因组计划中起到了重要的作用并得到了长足的发展。简单的说就是成千上万的DNA分子作为探针以有序或者无序的方式通过共价键或者非共价键排列到微型化的基底表面(可以是尼龙膜，硝酸纤维素膜，玻片，云母片，硅片等)[1-5]，分别与常人和患者DNA杂交和比对分析，就能获得病变的DNA信息，成为一项诊断新技术。DNA检测技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。1、芯片制备-制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。上述四个步骤中，DNA探针固定是DNA检测技术的关键问题，要构筑DNA芯片，首先必须先将与待测靶分子碱基序列互补的探针修饰到基底材料上，构筑一个识别层，然后才能根据碱基互补原则通过杂交反应检测其互补片段。探针固定是研究中的核心技术和首要问题。因此，借助有效的物理、微纳制造技术和化学修饰方法在硅片表面构筑识别层已成为广大科技工作者竞相研究和探索的目标。基因芯片的制备主要依赖于微细加工(microfabrication)、自动化(automatism)及化学合成技术。通常比较典型的DNA探针固定的方法有：(1)吸附法：吸附法是通过非共价键作用将直接或恒电位吸附而修饰到基底材料表面，或由片段中带负电荷的磷酸骨架与带正电荷的基底材料表面修饰层通过静电作用而固定。该法不需要特殊试剂或对分子进行特殊修饰衍生化，固定速度快。传统生物学实验中就是通过吸附方法固定到尼龙膜上。吸附法是一种最简便固定DNA的方法，但通过吸附固定DNA在高盐浓度环境中容易从电极表面脱落，所以不宜在高盐浓度条件下使用。另外，它是多位点吸附形式，通过中子反射研究[6-7]显示：固定的DNA可能平躺在电极表面，减小DNA固定化密度，同时使DNA片段运动自由度减小，影响杂交效率。因此吸附法不是DNA芯片和传感器研究的最佳选择。(2)SAM法(self-assemblymonolayer)：SAM法是基于分子自组(分子间化学键)作用，在固体表面上自然地形成高度有序的单分子自组膜方法[8-10]。SAM的形成是基于长链有机分子头基与基底之间强烈的化学键合作用、自组分子链之间范德华相互作用以及分子链内或末端特殊功能团之间的相互作用。自组装膜法得到的ssDNA修饰表面高度有序、稳定性好，在适当固定密度下，对互补DNA有很高的杂交效率；但它对疏基修饰的纯度要求较高，分离提纯操作繁琐，由于大的亲水性核酸基团，也较难产生一个紧密堆积表面，并且有一定非特异性吸附结合。(3)共价键合法：共价键合法是通过化学偶联试剂或经特殊修饰的DNA链利用表面化学反应将DNA固定到支撑物表面的方法。一般分两步进行：第一步是基底活化预处理，以引入各种所需活性基团(如羧基、羟基、氨基等)；第二步是进行基底表面的有机合成，用双官能试剂或化学偶联活化剂通过共价键合反应把功能分子固定到基底表面。分子通过共价键(如酰胺键、酯键、醚键等)而与基底表面结合。优点在于该法DNA是通过核酸链末端单点进行固定(而吸附法通常是沿核酸链多点固定)，因而固定的探针分子牢固且结构灵活可变，在杂交过程中可以调整构象以利于杂交反应进行。共价键合法可得到稳定的修饰层，提高探针的牢固度及耐用性，易进行分子杂交。目前分子自组单层膜技术已经广泛地应用于DNA在金表面的共价固定。方禹之等用氨基硫醇在金电极表面自组装导入氨基，在化学偶连活化剂水溶性碳二亚胺(EDC)存在下，经缩合反应将探针DNA分子共价固定在电极表面。Mirsky等利用烷基硫醇修饰后的金电极共价固定NH2-DNA，研究了不同固定条件对固定密度的影响。金表面的自组-共价固定法不要求对表面进行特殊处理，因此相对来说是一种较为简便的方法。但其局限性在于只能应用于金表面，要想实现在硅基底上共价固定DNA探针还需要寻找另一种化学偶连活化剂。短链分子因其头基的多样性和灵活性，逐渐被人们所认识，并且吸引越来越多的人的研究兴趣。其中芳香族重氮盐因其重氮基可以被其他基团取代，生成多种类型的产物，近年来，许多研究者把芳香烃重氮盐有机分子通过电化学方法应用到硅基底上，通过这一中间介质可以实现硅-金属、硅-生物分子以及硅-碳纳米管的连接[11,12]。2006年汉城的学者BumKeunYoo等人[13]将一端为羧基的重氮盐共价连接碳纳米管，之后再通过羧基的强吸电性实现了自组装功能性碳纳米管于银表面。2007年美国普渡大学的AdinaScott等人[14]通过电化学反应在氢终止的二氧化硅表面组装上一端带有活性基团的重氮盐分子，利用活性基团作为偶联剂实现了金属-重氮盐分子-硅器件的制造。通过化学自组装技术基于短链芳香烃分子可以实现硅基底固定DNA，但在固定结构的尺寸、位置和形状上都不可控，需要借助微纳加工技术来进一步辅助自组装过程有序进行。利用机械-化学方法在硅表面制造自组装微纳结构，这一过程在液态环境中进行，先通过机械刻划(如金刚石刀具刻划[15-17]、钨碳合金球刻划[18]、AFM针尖刻划等)使单晶硅表面的化学键如Si-O或Si-H、Si-Si键断裂，形成硅的自由基，进而引发它们与溶液中含有的有机分子共价结合以形成微纳结构。这样，硅基底上经过刻划的地方将引发聚合生长，实现了形状和位置可控的自组装结构制造技术，解决了单独应用自组装技术的弊端，而且用机械化学方法在硅片表面刻划生长的微纳结构在空气、水、热酸和X射线条件下的稳定性很好，这就使得它具有更好的应用前提。硅表面利用机械-化学相结合的方法制备微纳结构和表面改性的研究起步较晚，在国内关于这方面的报道都是本团队的研究成果[19-24]，国外学者在这方面做了一些工作[25-28]，提出可控自组装微纳结构可以通过在长链有机溶剂中用AFM针尖[29]、金刚石针尖刻划单晶硅表面本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：建立基于AFM的微纳加工系统；/nS2：利用微纳加工系统和机械-化学相结合的方法制作可控自组装芳香烃单层膜；/nS3：将DNA探针固定在所述芳香烃偶连层修饰的硅表面；/nS4：对DNA进行检测和表征。/n

【技术特征摘要】
1.一种短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：建立基于AFM的微纳加工系统；
S2：利用微纳加工系统和机械-化学相结合的方法制作可控自组装芳香烃单层膜；
S3：将DNA探针固定在所述芳香烃偶连层修饰的硅表面；
S4：对DNA进行检测和表征。


2.根据权利要求1所述的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，所述微纳加工系统包括AFM和三维精密微动工作台。


3.根据权利要求1所述的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，所述S2中，将预处理的硅基底放置于微加工系统的溶液池中，通过外部软件进行编程控制，设置显微镜的各项参数，扫描范围为0nm，设定点电压设置为刻划要求值，然后使针尖逼近样品，达到设定的弯曲量，驱动工作台沿着某一个方向移动，完成硅表面机械刻划的同时化学自组装同步进行。


4.根据权利要求3所述的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，所述硅基底采用硅片去油清洗后进行腐蚀氧化的硅片。


5.根据权利要求1所述的短链芳香烃分子介导硅基底固定DNA探针的方法，其特征在于，所述S3中，利用机械-化学方法在四氟化硼苯甲酸重氮中刻划硅表面，在其上制造规则有序的外端为羧基的自组装微纳结构，用氨基和荧光分别修饰单链DNA的两端，最后在共价偶联活化剂EDC的作用下，探针的氨基与微结构上的羧基反应形成酰胺键，就完成了DNA探针共价连接到微结构...

【专利技术属性】
技术研发人员：史立秋，于峰，项春，严爱芳，
申请(专利权)人：浙江水利水电学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33