一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒及其应用。本发明专利技术所的试剂盒中含有用于检测流感病毒的引物组和探针，包括3条引物和1条探针，为针对甲型流感病毒NP靶标基因设计的引物、探针组合。本发明专利技术的引物和探针适用于NASBA法检测甲型流感病毒，支持高通量、快速、准确地检测流感病毒感染，能够在1小时内获得较为实时荧光定量PCR方法更为准确的检测结果，对于临床应用具有重要意义。

A primer, probe and kit for detection of influenza A virus

【技术实现步骤摘要】
一种甲型流感病毒检测引物、探针及其试剂盒
本专利技术属于核酸扩增
，涉及一种用于检测流感病毒的试剂盒及其应用。
技术介绍
流行性感冒(简称流感)是流感病毒引起的急性呼吸道感染，其特点是传染性强、传播速度快。流感是由流行性感冒病毒引起的疾病，因此，可以通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。典型的临床症状是：急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。本病具有自限性，但在婴幼儿、老年人和存在心肺基础疾病的患者容易并发肺炎等严重并发症而导致死亡。一般秋冬季节是其高发期，且非常容易发生大范围流行。例如1918～1919年的世界流感大流行中，全球预估至少2000万～4000万人死于流感。流行性感冒病毒简称流感病毒，主要分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，近年来新发现的牛流感病毒被归类为丁(D)型。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病，是人流感、禽流感、猪流感、马流感等人与动物疫病的病原。人流感主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒引起的；丙型流感病毒虽然也能感染人类，但其抗原稳定，致病力较弱，主要侵犯幼儿和免疫力低下的人群。甲型流感病毒是最为常见的流感病毒，其亚型被称为禽流感。甲型流感病毒最容易发生抗原变异，这种变异被称为“飘变”(drift)，形象地说，“飘变”就是病毒通过细小的变化伪装自己，从而达到躲避人体免疫系统识别的目的。流感大流行就是甲型流感病毒出现新亚型或旧亚型重现引起的。甲型流感病毒可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型(其中的H和N分别代表流感病毒两种表面糖蛋白)。甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。乙型流感病毒的抗原变异较小，通常只引起流感的局部爆发。因此，在流感高发季节，甲型流感病毒的检测排查尤为重要。早期快速诊断流感感染能够及时指导临床治疗，为合理选择抗病毒抗细菌药物提供依据；尤其是甲型流感病毒的检测，对流感疫情监测、防止新亚型出现、预防流感大流行具有重要意义。而甲型流感病毒又分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9等亚型。因此，专利技术一种能够同时快速准确检测大部分甲型流感病毒的方法和试剂盒显得尤为迫切。目前检测常见流感病毒的方法较多，但都存在不足，如电镜检测方法复杂昂贵，病毒分离培养耗时极长且假阴性较多，在拿到培养结果后通常已失去临床意义，酶联免疫法检测的是病毒特异性抗体但一次仅能检测一种病毒。而基于核酸扩增的核酸检测，由于速度快(通常3小时内可完成检测)、灵敏度高、特异性好，在病毒检测领域正逐渐成为金标准。但上述方法难以做到对各不同亚型的流感病毒的统一检测。本专利技术的目的即为提供一种能够同时检测大多数甲型流感病毒，且检测时间短、检测结果准确的方法及其试剂盒。具体的，本专利技术的试剂盒能够在1小时内完成，且操作简便，特异性强。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于检测流感病毒的引物组和探针。本专利技术的引物和探针是可用于NASBA(Nuclearacidsequence-basedamplification，核酸依赖性扩增检测技术)检测的引物和探针。NASBA是一项以RNA模板进行等温核酸扩增并能实时观测结果的检测方法。该技术的检测反应有赖于AMV逆转录酶、噬菌体T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。NASBA已经广泛应用于细菌、病毒等多种病原微生物的检测。尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术(通过反转录形成单链DNA模板)，但与NASBA相比，NASBA则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行(一般恒温为41摄氏度)。该技术主要用于医学诊断，相对传统的PCR技术更为稳定、准确。本专利技术所提供的用于检测甲型流感病毒的引物组，由如下3条引物组成：由序列表中序列1所示的正向引物和序列2、序列3分别所示的两条反向引物组成。所述引物组基于甲型流感病毒保守NP基因序列设计，能够检测多种甲型流感病毒，但对乙型和丙型流感病毒无特异性。NP蛋白抗原稳定，不受抗原漂移的影响，通常是用来鉴定A、B和C型流感病毒的主要靶标。通过对不同甲型流感病毒NP基因序列比对，本申请专利技术人鉴定出基本在所有甲型流感病毒中均高度保守的一段NP基因序列，并基于该序列设计了一对引物(分别如序列1所示的正向引物和序列2所示的反向引物)和1条探针(如序列4所示)；但在实际临床应用检测中，本申请专利技术人发现，仍有一部分实际为甲型流感病毒患者不能使用上述引物和探针检测得出。通过对该部分患者样品中的病毒分离测序，专利技术人发现，这些患者中的甲型流感病毒，其NP基因序列在第1315位其发生了完全的变化，导致上述引物无法扩增该片段；而比对发现，上述新的NP基因在现有技术中并无记载。推测因为上述型甲型流感病毒相对少见，故尚未发现。基于上述发现，本专利技术人又设计了一条基于上述变化序列的反向引物(如序列3所示)；并将其与上述序列1和2所示引物组成3引物组合。因此，本专利技术的第二个目的是提供一种用于检测流感病毒的试剂盒。本专利技术所提供的用于检测流感病毒的试剂盒，由所述引物组和探针组成；所述试剂盒包含3条引物和1条探针，所述3条引物由1条正向引物和2条反向引物组成；其中，所述正向引物，其序列如序列1所示；所述反向引物1，其序列如序列2所示；所述反向引物2，其序列如序列3所示；所述探针，其序列如序列4所示。所述试剂盒中的探针的5’端标记有荧光报告基团，优选为荧光报告基团FAM；3’端标记有荧光淬灭基团，优选为荧光淬灭基团TAMRA。任选的，所述试剂盒还含有内对照引物对和内对照探针，所述内对照引物对如序列表中序列5和序列6所示；所述内对照探针为序列表中序列7所示的探针；所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团，优选为荧光报告基团FAM；3’端标记有荧光淬灭基团，优选为荧光淬灭基团TAMRA。任选的，所述试剂盒中还含有恒温扩增缓冲液；所述恒温扩增缓冲液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：250mMpH8.0的Tris-HCL，80mMDTT，15mMdNTP，15mMrNTP，60mMMgCl2，250mMKCl，10％DMSO(V/V)，10mMDTT。任选的，所述试剂盒中还含有恒温扩增酶溶液；所述恒温扩增酶溶液的溶剂为无菌水，溶质及浓度如下：AMV反转录酶1U/μl，T7RNA聚合酶5U/μl，核糖核酸酶H0.5U/μl，RNA酶抑制剂5U/μl，BSA0.5μg/μl。本专利技术另一目的是提供一种检测甲型流感病毒方法，包括临床应用及非疾病诊断和治疗目的的检测，如实验室科研需要的检测。所述方法包括如下步骤：(1)核酸提取：取临床待测样本，进行病毒核酸提取；(2)恒温扩增：取15μl恒温扩增缓冲液、10μl恒温扩增酶溶液、25μl步骤(1)得到的临床样本溶液混合成50μl反应溶液，旋涡震荡均匀后注入装载有引物组和探针的扩增反应器中；将反应器至于恒温扩增仪，40℃反应50min；(3)结果判定：反应结束后，根据各本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有基于甲型流感病毒NP靶标基因的引物和探针，所述引物和探针可通过NASBA法检测甲型流感病毒。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有基于甲型流感病毒NP靶标基因的引物和探针，所述引物和探针可通过NASBA法检测甲型流感病毒。


2.根据权利要求1所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含3条引物和1条探针，所述3条引物由1条正向引物和2条反向引物组成；
其中，所述正向引物，其序列如序列1所示；
所述反向引物1，其序列如序列2所示；
所述反向引物2，其序列如序列3所示；
所述探针，其序列如序列4所示。


3.根据权利要求2所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。


4.根据权利要求3所述的用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。


5.根据权利要求1-4任一项所述用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有内对照引物对和内对照探针，所述内对照引物对如序列表中序列5和序列6所示；所述内对照探针为序列表中序列7所示的探针；所述内对照探针的5’端标记有荧光报告基团FAM，3’端标记有荧光淬灭基团TAMRA。


6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：连一霏，崔江河，王菡，代海兵，连续，李荣辉，鞠传余，于龙魅，徐明鑫，梁爽，
申请(专利权)人：牡丹江医学院，
类型：发明
国别省市：黑龙;23