新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。本发明专利技术以新型冠状病毒（2019‑nCoV）的特异性核酸序列为靶基因，设计LAMP扩增引物，基于环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便的优势，建立了一套新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术检测方法，基于该检测方法构建了可视化恒温新型冠状病毒快速检测试剂盒。本发明专利技术试剂盒可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为30min。本发明专利技术试剂盒可实现快速、准确检测新型冠状病毒的目的，具有良好的应用前景。

Novel coronavirus visual constant temperature and rapid detection kit

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒可视化恒温快速检测试剂盒
本专利技术涉及核酸检测
，具体地说，涉及新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒是2019年12月以来新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎/肺部感染，2020年1月12日被世界卫生组织命名为“2019-nCoV”。目前新型冠状病毒的的检测方法为核酸检测方法，常用普通PCR及荧光定量PCR。应用这些检测方法新型冠状病毒进行检测，不仅对仪器及实验室环境要求较高，并且操作过程复杂，对操作人员技术要求严格，检测时间较长。尤其受限于基层检测设备及人员的限制，严重影响了该病毒的检测效率。因此，迫切需要建立一种设备简单并且操作便捷的快速、高效、特异性高的检测新型冠状病毒的技术，以满足基层检测及快速筛查的需求。环介导恒温扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP）是2000年由日本学者Notomi开发的一门新兴的基因扩增技术，具有特异性强、灵敏性高、等温高效、操作简便、成本低廉等优点。但由于LAMP扩增是链置换合成，靶序列长度在300bp以内，大于500bp则较难扩增，故不能进行长链RNA的扩增。由于灵敏度高，极易受到污染而产生假阳性结果，因此特别注意严谨操作，来防范非特异性扩增与污染。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供新型冠状病毒可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒。本专利技术的另一目的是提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法。本专利技术构思如下：根据NCBI公布的武汉新型冠状病毒基因组序列（GenBankNo.:NC_045512.2），将新型冠状病毒2019-nCoV的保守靶基因ORF1ab（序列见SEQIDNO:7）与SARS、MERS等病毒进行序列同源性比对分析，2019-nCoV目标基因序列与SARS同源性为73%，与MERS同源性210.1%。在相对区分度较高区段，利用LAMPDesiner2.0软件进行引物设计。利用恒温快速核酸扩增技术，在恒温条件下，呈指数级别放大核酸分子特性，其在30分钟内将病毒核酸分子放大109~1010倍。扩增完成后，放大的核酸分子与OG（Orange-Green）染料结合，由橙色变为鲜艳的绿色，通过肉眼观察即可判定样本中是否含有目标病毒分子，阳性样本为鲜艳的绿色，阴性样本为橙黄色，从而建立一套可视化恒温新型冠状病毒快速检测方法，为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，所述LAMP引物包括如SEQIDNO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQIDNO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。第二方面，本专利技术提供一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物组，包括SEQIDNO:1-4所示的LAMP引物以及如SEQIDNO:5-6所示的环引物LoopF和LoopB。第三方面，本专利技术提供含有如SEQIDNO:1-4所示LAMP引物或如SEQIDNO:1-6所示引物组的检测试剂或试剂盒。第四方面，本专利技术提供一种新型冠状病毒2019-nCoV可视化恒温（免核酸提取）快速检测试剂盒，所述试剂盒包含如SEQIDNO:1-6所示引物组，还包含dNTPs、BstDNA聚合酶（优选Bst4.0DNA聚合酶）、海藻糖、OG染料、TrisHCl，TrionX-100，含Mg2+的反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。该试剂盒可用于感染新型冠状病毒肺炎的早期诊断。第五方面，本专利技术提供如SEQIDNO:1-4所示LAMP引物或如SEQIDNO:1-6所示引物组在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂或试剂盒中的应用。所述试剂或试剂盒为用于LAMP法的试剂或试剂盒。第六方面，本专利技术提供一种检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法（含非诊断目的），包括以下步骤：1）用650μl反应缓冲液溶解50mgOG冻干反应试剂，得到OG反应试剂；然后在反应管底部加入20µlddH2O，加入20μlOG反应试剂，再加入20μl待测样品，混匀后加入10μlOG染料，进行LAMP扩增反应及显色反应；2）扩增结果判定（荧光染色法）：若反应体系由橙色变为绿色，表明待测样品中含有新型冠状病毒2019-nCoV。步骤1）中所述反应缓冲液的组成如下：Tris-HCl20mM，pH8.8MgSO46mMTrionX-1000.1%所述OG冻干反应试剂的组成如下：Bst4.0DNA聚合酶0.4U/μldNTPs0.2μM海藻糖10%引物F34μM引物B34μM引物FIP32μM引物BIP32μM环引物LoopF16μM环引物LoopB16μM进行LAMP扩增反应采用的最佳反应条件为：60℃30分钟。应理解的是，步骤2）也可以采用如下①或②的方法替代荧光染色法，进行扩增结果判定：①琼脂糖凝胶电泳法：若扩增产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，表明待测样品中含有新型冠状病毒2019-nCoV；②焦磷酸镁浊度检测法：通过肉眼观察反应后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP扩增反应，或利用浊度仪检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。本专利技术中，所述待测样品可以是获自疑似患有新型冠状病毒2019-nCoV的人或其它动物的样品，如痰液、支气管肺泡灌洗液、鼻溢、鼻吸出物、鼻洗剂、鼻海绵、咽拭子、唾液、血液、血清、血浆、脊髓液、尿液、粪便及组织。此外，包括例如用于感染实验等的细胞及其培养液，或从获自生物的样品或培养细胞分离的病毒的样品也可作为样品。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：本专利技术以新型冠状病毒（2019-nCoV）的特异性核酸序列为靶基因，设计LAMP扩增引物，基于环介导等温扩增技术的高特异性、高敏感性、简便的优势，建立了一套新型冠状病毒恒温快速核酸扩增技术检测方法，基于该检测方法构建了可视化恒温新型冠状病毒快速检测试剂盒。本专利技术试剂盒可将浓度为5拷贝/μl的标准质粒有效检出，反应时间仅为30min。本专利技术试剂盒可直接利用简易设备（水浴锅或金属浴）对待测样品（如咽拭子浸泡液样品）进行免核酸提取的新型冠状病毒的直接检测、肉眼可视化检测。可用于快速诊前分离，适合于户外操作。本专利技术试剂盒可实现快速、准确检测新型冠状病毒的目的，具有良好的应用前景。附图说明图1为本专利技术实施例3中PCR扩增产物的琼脂糖凝胶检测结果。其中，M为DNAMarker，1和2为PCR扩增产物，大小为381bp。图2为本专利技术实施例3中LAMP检测的灵敏度实验结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括如SEQ ID NO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQ ID NO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括如SEQIDNO:1-2所示的外侧正向引物F3和外侧反向引物B3，以及如SEQIDNO:3-4所示的内侧正向引物FIP和内侧反向引物BIP。


2.用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的引物组，其特征在于，包括权利要求1所述的LAMP引物以及如SEQIDNO:5-6所示的环引物LoopF和LoopB。


3.含有权利要求1所述LAMP引物或权利要求2所述引物组的检测试剂或试剂盒。


4.新型冠状病毒2019-nCoV可视化恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述引物组，还包含BstDNA聚合酶、dNTPs、海藻糖、OG染料、TrisHCl，TrionX-100，含Mg2+的反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。


5.权利要求1所述LAMP引物或权利要求2所述引物组在制备用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂或试剂盒中的应用。


6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述试剂或试剂盒为用于LAMP法的试剂或试剂盒。


7.非诊断目的检测新型冠...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔尚金，梁琳，贾亚雄，梁瑞英，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11