一种新型冠状病毒RT-PCR检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种新型冠状病毒2019‑nCoV实时荧光RT‑PCR检测方法及试剂盒，具体的地，本发明专利技术公开了一种检测新型冠状病毒2019‑nCoV的E基因核酸的试剂盒及方法，具有极高的灵敏度和特异性，并且能够显著提高病毒鉴定的准确性。

A novel coronavirus RT-PCR detection method and kit

【技术实现步骤摘要】
一种新型冠状病毒RT-PCR检测方法及试剂盒
本专利技术属于生物技术和分子诊断领域，具体地说，本专利技术涉及一种新型冠状病毒2019-nCoV实时荧光RT-PCR检测方法及试剂盒。
技术介绍
2019年12月以来，陆续发现了多例不明原因肺炎病例，现已证实为一种新型冠状病毒感染引起的急性呼吸道传染病。基于目前的流行病学调查，潜伏期一般为3-7天，最长不超过14天。此次疫情临床表现以发热、乏力、干咳为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等症状。部分患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现，多在1周后恢复。鉴于该病潜伏期患者也可进行人传人现象，目前迫切需要一种灵敏和精确的方法，用于快速检测2019新型冠状病毒感染所引起的肺炎的。而《新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案》明确规定疑似病例，需要具备以下病原学证据之一者才能确诊：1.呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2.呼吸道标本或血液标本病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。实时荧光RT-PCR是冠状病毒核酸检测常用方法之一，可用于实验室检查、流行病学研究、排除诊断等。该方法灵敏度高、特异性好，可以准确快速提供目标病毒的检测结果。目前，对新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光RT-PCR鉴定，主要针对新型冠状病毒基因组开放读码框1a/b（openreadingframe1ab，ORF1ab）和核壳蛋白（nucleocapsidprotein，N）。但是，鉴于RNA病毒变异速度较快，容易对突变病毒造成漏检，不利于病毒的及时发现与防控。因此，有必要开发针对性的检测体系，预防可能因突变而引起的漏检。
技术实现思路
本专利技术针对新型冠状病毒基因组膜蛋白（envelopeprotein，E）开发了新型冠状病毒诊断体系。以便能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测，并预防可能出现的变异性。在本专利技术的第一方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的引物对集，所述引物对集包括：第一引物对组，所述第一引物对组包括：如SEQIDNO.1所示的正向引物；和，如SEQIDNO.2所示的反向引物。在另一优选例中，所述引物对集还包括：内标引物对组，所述内标引物对组包括：如SEQIDNO.4所示的正向引物；和，如SEQIDNO.5所示的反向引物。本专利技术的第二方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的探针组，所述探针组包括核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探针。在另一优选例中，所述探针组还包括核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的内控探针。在另一优选例中，各探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，各探针的3’端包含有荧光淬灭基团。在另一优选例中，各探针标记的荧光报告基团互不相同。本专利技术的第三方面，提供了一种用于多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，所述试剂盒包括本专利技术第一方面所述的引物对集。在另一优选例中，所述试剂盒还包括本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQIDNO.1-6所示的多核苷酸序列。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含RT-PCR反应酶系，所述RT-PCR反应酶系包括热启动酶、和逆转录酶C-MMLV；优选地还包括dNTPs。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含RT-PCR反应液。在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含DEPCH2O。本专利技术的第四方面，提供了一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的方法，所述方法包括步骤：（1）提供待检测对象的核酸样本；（2）制备RT-PCR反应体系并进行RT-PCR检测：其中，所述RT-PCR反应体系包括：步骤（1）提供的所述核酸样本、本专利技术第一方面所述的引物对集、和本专利技术第二方面所述的探针组。在另一优选例中，所述核酸样本可来自咽拭子样本、肺泡灌洗液样本、血液样本、痰液样本、粪便样本或环境样本。在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法。在另一优选例中，所述RT-PCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。在另一优选例中，所述RT-PCR反应体系还包括RT-PCR酶系。本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的引物对集、和/或本专利技术第二方面所述的探针组的用途，用于制备PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1：优化检测体系的扩增曲线；图2：灵敏度检测结果；图3：特异性测试结果；图4：重复性测试结果；图5：典型临床样本检测结果；图6：对照引物对E-NCOV-F2和E-NCOV-R2的检测结果；图7：对照引物对E-NCOV-F3和E-NCOV-R3的检测结果。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得一种多重检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒及方法，通过针对性检测新型冠状病毒2019-nCoV的膜蛋白核酸靶标，能够高效率、高特异性、低成本的对新型冠状病毒2019-nCoV感染患者进行检测，并预防可能因病毒变异性而出现的假阴性，对可能因突变而引起的漏检进行确认，显著提高了病毒鉴定的准确性。在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。多重PCR多重PCR(multiplexPCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。影响多重PCR反应的因素有很多，比如：（1）反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针组；/n其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，/n所述第一引物对包括：/n如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物，/n所述内标引物对包括：/n如SEQ ID NO.4所示的正向引物和如SEQ ID NO.5所示的反向引物；/n所述探针组包括：/n核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的第一探针和核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的内控探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒2019-nCoV核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括引物对集和探针组；
其中，所述引物对集包括第一引物对和内标引物对，
所述第一引物对包括：
如SEQIDNO.1所示的正向引物和如SEQIDNO.2所示的反向引物，
所述内标引物对包括：
如SEQIDNO.4所示的正向引物和如SEQIDNO.5所示的反向引物；
所述探针组包括：
核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的第一探针和核苷酸序列如SEQIDNO.6所示的内控探针。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含所述引物对集和所述探针组。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第二容器，所述第二容器内包含RT-PCR反应酶系，所述RT-PCR反应酶系包括热启动Taq酶和逆转录酶。


4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述第二容器内还包含dNTPs。


5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包括Tris-HCl缓冲液、Mg2+和Tween-20。


6.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含DEPCH2O。

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【专利技术属性】
技术研发人员：蒋析文，廖芷卉，范建，
申请(专利权)人：中山大学达安基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44