本发明专利技术属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲤冠状病毒HL39的RT‑RPA检测引物及应用。本发明专利技术是针对保藏编号为CCTCC NO：V201988的鲤冠状病毒HL39设计的RT‑RPA检测引物，包括特异性引物和探针本发明专利技术具有操作简便、反应快速、高特异性和灵敏性的特点，不需大型仪器设备，30分钟内即可准确检测出样品中的鲤冠状病毒HL39，最低检测限可达4.9 fg/μL的RNA模板，非常适用于现场快速检测和大规模筛查。
Rt-rpa primer for detection of carp coronavirus hl39 and its application
【技术实现步骤摘要】
一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物及应用
本专利技术属于病毒分子检测
，具体涉及一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物及应用。
技术介绍
套式病毒目(Nidovirales)于1996年首次由国际病毒分类委员会(InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses,ICTV)提出，该目病毒宿主广泛，可引起哺乳动物、鸟类、爬行动物、鱼虾等水生动物多种重大疾病。套式病毒目冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。由冠状病毒科的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起的非典型性肺炎，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。2018年ICTV调整了套式病毒目的分类，新增了Abyssoviridae、Medioniviridae、Mononiviridae、Euroniviridae和Tobaniviridae等5个病毒科，其中在Tobaniviridae科下新增Oncotshavirus属。2017年，申请人发表了鲫冠状病毒的相关研究成果，目前鲤冠状病毒(CyprinidNidovirus,CyNV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。申请人首次从鲤鱼病变组织中分离出一株鲤冠状病毒，针对该病毒，设计了RT-RPA反应引物，从而实现鲤冠状病毒的快速、精确检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物，所述的引物为：HL39-F：5，-GGAAAACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCTACT-3，和HL39-R：5，-AGTGCCGGTGGTTGAGAGCTTGTAGGACGTTCT-3，，所述病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201988。本专利技术的另一个目的在于提供了一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物的应用，利用该引物，可制备成鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物，所述的引物为：HL39-F：5，-GGAAAACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCTACT-3，和HL39-R：5，-AGTGCCGGTGGTTGAGAGCTTGTAGGACGTTCT-3，，所述病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201988。鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物在制备成鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒中的应用；以上所述的应用中，优选的，所述的鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒包括：Tris-HCl，醋酸钾，醋酸镁，dNTPs，肌酸激酶，磷酸肌酸，二硫苏糖醇，ATP，PEG35K，引物HL39-F和HL39-R，探针，UvsX，UvsY，聚合酶Bsu，gp32单链结合蛋白，外切酶Ⅲ，反转录酶，RNA模板。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术公开了一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物，利用该引物制备的试剂盒，特异性好，能有效检测出鲤冠状病毒HL39；灵敏性好，最低检测限可达4.9fg/μL的RNA模板；快速高效，检测时间约30分钟，非常适用于鲤冠状病毒HL39的现场快速检测和大规模筛查；鉴定简单，通过实时荧光检测，可提高结果的灵敏度和客观性。具体实施方式本专利技术所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。实施例1：一种鲤冠状病毒HL39，其分离过程如下：1)将携带病毒的鲤鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grasscarpovarycellline,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂，培养基：M199，10％胎牛血清，pH7.0～7.2；2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQIDNO.1所示。鲤冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2019年11月26日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲤冠状病毒(CyprinidNidovirus)HL39，保藏编号：CCTCCNO：V201988，地址：中国武汉武汉大学，本专利技术或称该病毒为CyNV-HL39。实施例2：基于鲤冠状病毒HL39的全序列(SEQIDNO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的RT-RPA检测引物为：HL39-F：5，-GGAAAACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCTACT-3，；HL39-R：5，-AGTGCCGGTGGTTGAGAGCTTGTAGGACGTTCT-3，。实施例3：利用鲤冠状病毒HL39的RT-RPA引物对CyNV-HL39进行检测，方法步骤如下：：1)、病毒RNA的获取：采用或LS试剂或柱吸附洗脱法提取样本总RNA。2)、RT-RPA扩增体系的配制：采用25μL反应体系：Tris-HCl(pH7.9)50mM，醋酸钾100mM，醋酸镁14mM，dNTPs200μM，肌酸激酶100ng/μL，磷酸肌酸50mM，二硫苏糖醇2mM，ATP3mM，PEG35K5％，引物HL39-F和HL39-R各300nM，探针HL39-P100nM，UvsX120ng/μL，UvsY60ng/μL，聚合酶Bsu30ng/μL，gp32单链结合蛋白600ng/μL，外切酶Ⅲ5U，反转录酶10U，RNA模板2μL，上下颠倒充分混匀，低速离心10秒。探针HL39-P：5，-TCAATATAACTTAAATCTCTTTTAGAA[FAM-dT]CG[THF]GC[BHQ1-dT]AGCGCAAACCTTC-C3Spacer-3，。根据RT-RPA荧光检测方法的原理，以上相关组分可在一定范围内调整，或选择其它有效的RT-RPA通用荧光检测试剂作为替换。3)RT-RPA扩增将反应管放入荧光检测仪中，39℃预热60秒；39℃反应30秒，40循环，选择FAM荧光通道，并收集荧光信号。4)检测结果判定根据荧光检测仪设定基线和阈值，阴性对照无典型扩增曲线出现，阳性对照出现明显的扩增曲线，则实验成立，否则实验无效。在对照成立的情况下，样品出现明显的扩增信号本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物，所述的引物为：HL39-F：5
【技术特征摘要】
1.一种鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物，所述的引物为：HL39-F：5，-GGAAAACCTCTTACACTCTGCCCCTTTACCTACT-3，和HL39-R：5，-AGTGCCGGTGGTTGAGAGCTTGTAGGACGTTCT-3，，所述病毒的保藏编号为CCTCCNO：V201988。
2.权利要求1所述的鲤冠状病毒HL39的RT-RPA检测引物在制备鲤冠状病毒HL39的检测试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的鲤冠状病...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑剑，陈孝宇，张彩霞，陈鑫，
申请(专利权)人：武汉海关技术中心，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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