茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT-PCR检测用引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术提供的茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT

【技术实现步骤摘要】
茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物、试剂盒及方法


[0001]本专利技术属于植物检疫
，尤其涉及茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]茄科植物包括番茄(Lycopersicon esclulantum Mill)、马铃薯(Solanum tuberosum L.)、辣椒(Capsicum annuum L.)、烟草(Nicotiana tabacum L.)等重要蔬菜、经济和大田作物，在世界范围内广泛栽培，具有重要的经济价值。特别是马铃薯和番茄，分别是世界第一和第二大具有经济要性的蔬菜，在全世界173个国家种植。但茄科植物也是重要的病毒和类病毒寄主，被病毒或类病毒侵染后产量或品质降低，造成严重的经济损失。茄科类种子携带多种病毒和类病毒，主要包括凤果花叶病毒(pepino mosaic virus，PepMV)、马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid，PSTVd)、金鱼草潜隐类病毒(columnea latent viroid，CLVd)、辣椒小果类病毒(pepper chat fruit viroid，PCFVd)、番茄顶缩类病毒(tomato apical stint viroid，TASVd)、番茄褪绿矮缩类病毒(tomato chlorotic dwarf viroid，TCDVd)和番茄雄性株类病毒(tomato planta macho viroid，TPMVd)等7种病毒及类病毒。这些病毒侵染后对番茄的生长发育造成严重威胁，如PSTVd和TPMVd侵染番茄后导致植株矮化，发育不良，严重影响产量；后者还可以引起分蘖增多，叶片和果实严重变小，失去商品价值等严重后果。茄科植物是重要的进出口商品，进出口数量逐年增加。如2020年我国辣椒干进口量为15.55万吨，进口金额为35411.1万美元，同比增长14.9％。
[0003]除了在我国马铃薯植株中检测到PSTVd和凤果(Solanum muricatum)叶片中检测到了PepMV外，其它类病毒在我国茄科植物上尚未报道。此外，我国研究人员很少在种子中对这些病毒和类病毒开展检测研究，缺乏相应的检测技术和检测产品。开展茄科植物病毒和类病毒的检测技术研究尤为重要。
[0004]目前，茄科植物病毒和类病毒的主要检测方法有生物学测定、血清学测定、电子显微镜技术和分子生物学技术。2020年我国研究人员建立基于单克隆抗体的检测番茄中PepMV的双抗夹心酶联免疫吸附试验、斑点酶联免疫吸附试验和组织印迹酶联免疫吸附试验三种血清学检测方法。但类病毒不编码蛋白质，植物病毒检测最常用的ELISA技术不能用于类病毒检测。Hoshino等人采用RT
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PCR于2006年对番茄种子携带的PSTVd进行检测，从2000颗种子中检测到了1颗PSTVd感染种子；Bakker等人于2015年对番茄种子携带的PSTVd和TCDVd开展检测研究，建立了灵敏、稳定的实时荧光定量RT
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PCR检测技术，曾从1000颗种子中检测到1颗PSTVd和TCDVd感染种子。Li等人于2012年对来自美国和墨西哥的番茄进行小干扰RNA(small inference RNA,siRNA)测序，检测到了PSTVd和PepMV，siRNA拼接获得了全长基因组中98％的序列。本申请人从2016年以来采用第二代测序NGS技术测定了园艺植物的宏基因组及小干扰性RNA，先后从梨、桃、猕猴桃、葡萄和野玫瑰样品中鉴定出病毒和类
病毒近50种，鉴定并命名新病毒近10个。NGS技术的应用需要采用多种软件分析，包括去接头、拼接、比对和分析软件，目前国外已有一些研究团队整合了这些软件开发出一体化分析程序，例如基于RNA
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Seq或基因组测序数据分析的PathSeq、VirusFinder、VirusSeq、VirusHunter和基于siRNA数据的Paparazzi和VirusDetect等。但这些工具仍存在在线服务不稳定、界面不友好、专业性过强等弊端。且受技术、成本和时间过长(1
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2月)的限制，尚未在海关普遍应用。
[0005]因此，急需在分子检测技术基础上开开发出灵敏度高、特异性强、快速、精准的检测方法，避免因同属的不同类病毒间序列相似性较高，相互之间可能会发生杂交反应，产生的假阳性现象，以实现茄科植物PepMV、PSTVd、CLVd、PCFVd、TASVd、TCDVd和TPMVd等7种病毒及类病毒的精准检测，确保为我国海关进出境茄科植物种子检疫提供技术和产品支撑。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物、试剂盒及方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0008]本专利技术的第一目的是提供茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物，所述茄科植物病毒包括PepMV，茄科植物类病毒包括PSTVd、CLVd、PCFVd、TASVd、TCDVd和TPMVd，其特征在于，所述引物包括检测PepMV的引物对如SEQ ID NO:1
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2所示、检测PSTVd的引物对如SEQ ID NO:7
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8所示、检测CLVd的引物对如SEQ ID NO:9
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10所示、检测PCFVd的引物对如SEQ ID NO:11
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12所示、检测TASVd的引物对如SEQ ID NO:13
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14所示、检测TCDVd的引物对如SEQ ID NO:15
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16所示和检测TPMVd的引物对如SEQ ID NO:17
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18所示；或者所述引物包括检测PepMV的引物对如SEQ ID NO:1
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2所示、检测PSTVd的引物对如SEQ ID NO:19
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20所示、检测CLVd的引物对如SEQ ID NO:21
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22所示、检测PCFVd的引物对如SEQ ID NO:23
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24所示、检测TASVd的引物对如SEQ ID NO:25
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26所示、检测TCDVd的引物对如SEQ ID NO:27
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28所示和检测TPMVd的引物对如SEQ ID NO:29
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30所示。
[0009]进一步的，还包括保守基因NdhB的引物对如SEQ ID NO:3
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4所示，类病毒通用引物Pos
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vd的引物对如SEQ ID NO:5
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6所示。
[0010]本专利技术的第二目的是提供一种茄科植物病毒及类病毒的检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物。
[0011]本专利技术的第三本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物，所述茄科植物病毒包括PepMV，茄科植物类病毒包括PSTVd、CLVd、PCFVd、TASVd、TCDVd和TPMVd，其特征在于，所述引物包括检测PepMV的引物对如SEQ ID NO:1
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2所示、检测PSTVd的引物对如SEQ ID NO:7
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8所示、检测CLVd的引物对如SEQ ID NO:9
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10所示、检测PCFVd的引物对如SEQ IDNO:11
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12所示、检测TASVd的引物对如SEQ ID NO:13
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14所示、检测TCDVd的引物对如SEQ ID NO:15
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16所示和检测TPMVd的引物对如SEQ ID NO:17
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18所示；或者所述引物包括检测PepMV的引物对如SEQ ID NO:1
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2所示、检测PSTVd的引物对如SEQ ID NO:19
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20所示、检测CLVd的引物对如SEQ ID NO:21
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22所示、检测PCFVd的引物对如SEQ ID NO:23
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24所示、检测TASVd的引物对如SEQ ID NO:25
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26所示、检测TCDVd的引物对如SEQ ID NO:27
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28所示和检测TPMVd的引物对如SEQ ID NO:29
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30所示。2.如权利要求1所述的茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测用引物，其特征在于，还包括保守基因NdhB的引物对如SEQ ID NO:3
‑
4所示，类病毒通用引物Pos
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vd的引物对如SEQ ID NO:5
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6所示。3.一种茄科植物病毒及类病毒的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1
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2中任一项所述的引物。4.一种茄科植物病毒及类病毒的多重巢式RT
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PCR检测方法，其特征在于，采用如权利要求2所述的引物，包括以下具体步骤：S1、总RNA提取；S2、对步骤S1获得的RNA进行反转录，获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐文兴，李倩，王振华，王琴，
申请(专利权)人：武汉海关技术中心，
类型：发明
国别省市：