一种应用NGS检测HIV-1耐药基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用NGS检测HIV

【技术实现步骤摘要】
一种应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法


[0001]本专利技术涉及基因检测
，特别是涉及一种应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法。

技术介绍

[0002]目前HIV耐药检测方法主要有3种：基因型耐药检测(GART)、表型耐药检测(PART)和虚拟耐药检测(virtual phenotype，vPT)。传统的基因型耐药检测以核酸序列测定为基础，首先通过RT
‑
PCR扩增出HIV的蛋白酶和逆转录酶基因的核酸序列，通过Sanger测序获得序列信息，最后与参比毒株的核酸序列比较了解耐药位点是否发生变异。以Sanger测序为基础的检测方法准确性高、信息全面，是HIV耐药临床检测金标准。
[0003]然而，目前所采用的Sanger测序方法，其灵敏度低，对于20％以下的突变检测效果较差，并且，一次只能对一条DNA片段进行测序。

技术实现思路

[0004]针对上述问题，本专利技术提供了一种应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，检测准确性好、灵敏度高、可完成多位点同时检测，能够实现低频耐药突变的检测，对HIV
‑
1病毒的前期筛查检测及发病后医生制定更为有效的用药方案具有重要意义。
[0005]本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，包括以下步骤：
[0007]S1、检测样本收集；
[0008]S2、HIVr/>‑
1样本制备：从检测样本中提取HIV
‑
1病毒的RNA，通过RT
‑
PCR、巢式PCR扩增pol区包含耐药突变位点的基因片段，最后利用电泳对扩增样品进行检测；
[0009]S3、文库构建：对目的基因片段化、加标签，最后混合样本，变性稀释到上机浓度，达到可在Illumina测序平台上对混合文库进行双序列标签测序的要求；
[0010]S4、上机测序：采用最大产出为2.4G的中通量测序试剂盒，在Miniseq测序仪上对混合文库进行2
×
150bp的双端NGS测序；
[0011]S5、数据分析：对下机数据进行过滤、质控和拼接，从中提取出测序深度和覆盖率，并利用斯坦福大学HIV耐药解释系统对数据进行耐药分析与报告。
[0012]在进一步的技术方案中，步骤S1中，检测样本可为血浆样本或血清样本，其中，血浆样本采用的抗凝剂为EDTA。
[0013]在进一步的技术方案中，步骤S2中，对HIV
‑
1病毒RNA的提取的过程中，具体包括以下步骤：
[0014]S21、取出预封装试剂，颠倒混匀使磁珠重悬，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，沿板子方向小心撕去铝箔封口膜；
[0015]S22、在96深孔板试剂的第1列和第7列孔中先后加入体积比为10:1的样品和Proteinase K溶液，Proteinase K加入体积较小，需确保加入到液体中，将96深孔板放入核
酸提取仪中，装上磁棒套，确认磁棒套安装到位后进行自动化提取；
[0016]S23、自动化程序结束后，将第6列和第12列孔中的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，置于
‑
20℃保存。
[0017]在进一步的技术方案中，步骤S2中，利用电泳对扩增样品进行检测的过程中，具体包括以下步骤：
[0018]琼脂糖凝胶电泳：
[0019]称取琼脂糖到三角烧瓶中，然后加入1
×
TAE电泳缓冲液，放入微波炉中高火加热3
‑
5min，室温冷却到50℃左右，再加入TS
‑
GelRed核酸凝胶染色剂混匀，最后将上述溶液倒入制胶器中，室温下静置30min，待胶凝固后吸取产物与上述缓冲液混匀，加入琼脂糖加样孔中，电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40min后通过凝胶成像查看结果；
[0020]Qubit荧光定量：
[0021]制备1
×
TE缓冲液：用无核酸酶水将20
×
TE缓冲液稀释20倍，混匀；
[0022]制备染料工作液：用1
×
TE缓冲液按1:400稀释QuantiFluorRds DNA Dye并混匀；
[0023]在0.5ml Ep管中，将1
×
TE(空白)/和DNA standard/待测样本分别与100倍体积的染料工作液混合，涡旋混匀，室温下避光孵育5min后用仪器检测；
[0024]PCR产物稀释：
[0025]用无核酶水将定量后的PCR产物稀释到1ng/μl。
[0026]在进一步的技术方案中，步骤S3中，对目的基因片段化、加标签的过程中，具体包括以下步骤：
[0027]S31、短暂涡旋使TNB充分混匀，然后按照10μl 5
×
TTBL、1μl 1ng DNA、5μl TTE Mix V50、4μl ddH2O配制反应体系，使用移液器轻轻吹打使其充分混匀；
[0028]S32、将反应管置于PCR仪中进行反应，反应完成后立即向产物中加入5
×
TS，使用移液器轻轻吹打至充分混匀，置于室温放置5min；
[0029]S33、将PCR管置于冰上，按照25μl上一步产物、10μl 5
×
TAB、5μl N5XX、5μl N7XX、1μl TAE、4μl ddH2O配制反应体系；
[0030]S34、使用移液器轻轻吹打至充分混匀，将反应管置于PCR仪中进行反应。
[0031]在进一步的技术方案中，步骤S3还包括：
[0032]S35、吸取磁珠至片段化产物中，涡旋振荡或使用移液器吹打10次至充分混匀，室温孵育5min后将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后再移除上清；
[0033]S36、保持反应管始终处于磁力架上，加入配制好的80％乙醇漂洗磁珠室温孵育30s，移除上清，重复此步骤，总计漂洗两次；
[0034]S37、保持反应管始终处于磁力架上，开盖空气干燥5min；
[0035]S38、将反应管从磁力架上取出，加入灭菌超纯水洗脱，涡旋振荡或使用移液器吹打10次至充分混匀，室温孵育5min；
[0036]S39、将反应管短暂离心并置于磁力架上，使磁珠与液体分离，待溶液澄清后(约5min)吸取上清至新的灭菌PCR管中，
‑
20℃保存。
[0037]在进一步的技术方案中，在进行上机测序之前，还包括以下步骤：
[0038]Qubit荧光定量：
[0039]制备1
×
TE缓冲液：用无核酸酶水将20
×
TE缓冲液稀释20倍，混匀；
[0040]制备染料工作液：用1
×
TE缓冲液按1:400稀释QuantiF本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、检测样本收集；S2、HIV
‑
1样本制备：从检测样本中提取HIV
‑
1病毒的RNA，通过RT
‑
PCR、巢式PCR扩增pol区包含耐药突变位点的基因片段，最后利用电泳对扩增样品进行检测；S3、文库构建：对目的基因片段化、加标签，最后混合样本，变性稀释到上机浓度，达到可在Illumina测序平台上对混合文库进行双序列标签测序的要求；S4、上机测序：采用最大产出为2.4G的中通量测序试剂盒，在Miniseq测序仪上对混合文库进行2
×
150bp的双端NGS测序；S5、数据分析：对下机数据进行过滤、质控和拼接，从中提取出测序深度和覆盖率，并利用斯坦福大学HIV耐药解释系统对数据进行耐药分析与报告。2.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S1中，检测样本可为血浆样本或血清样本，其中，血浆样本采用的抗凝剂为EDTA。3.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S2中，对HIV
‑
1病毒RNA的提取的过程中，具体包括以下步骤：S21、取出预封装试剂，颠倒混匀使磁珠重悬，轻甩孔板，使试剂及磁珠均集中到孔板底部，沿板子方向小心撕去铝箔封口膜；S22、在96深孔板试剂的第1列和第7列孔中先后加入体积比为10:1的样品和Proteinase K溶液，将96深孔板放入核酸提取仪中，装上磁棒套，确认磁棒套安装到位后进行自动化提取；S23、自动化程序结束后，将第6列和第12列孔中的洗脱液转移至干净的无核酸酶离心管中，置于
‑
20℃保存。4.根据权利要求1所述的应用NGS检测HIV
‑
1耐药基因的方法，其特征在于，步骤S2中，利用电泳对扩增样品进行检测的过程中，具体包括以下步骤：琼脂糖凝胶电泳：称取琼脂糖到三角烧瓶中，然后加入1
×
TAE电泳缓冲液，放入微波炉中高火加热3min
‑
5min，室温冷却到50℃左右，再加入TS
‑
GelRed核酸凝胶染色剂混匀，最后将上述溶液倒入制胶器中，室温下静置30min，待胶凝固后吸取产物与上述缓冲液混匀，加入琼脂糖加样孔中，电泳仪电压设量为100v，恒压电泳，40min后通过凝胶成像查看结果；Qubit荧光定量：制备1
×
TE缓冲液：用无核酸酶水将20
×
TE缓冲液稀释20倍，混匀；制备染料工作液：用1
×
TE缓冲液按1:400稀释QuantiFluorRds DNA Dye并混匀；在0.5ml Ep管中，将1
×
TE/和DNA standard/待测样本分别与100倍体积的染料工作液混合，涡旋混匀，室温下避光孵育5min后用仪器检测；PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾颖，王超，詹杨丹，张伟，蒋琪琪，蒲秀枚，黄子懿，
申请(专利权)人：成都爱诺言医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：