EML4-ALK基因突变分析方法技术

根据本发明专利技术的一实施例，提供能够以比起现有的方法更灵敏的检测限检测基于血中循环癌细胞的EML4‑ALK基因突变的定量逆转录‑聚合酶链式反应(qRT‑PCR)用引物。根据本发明专利技术的另一实施例，提供难以采集肺癌组织的固态活检，即使在无法执行ALK‑荧光原位杂交(ALK‑FISH)检查的肺癌患者身上也可利用血中循环肺癌细胞来检测EML4‑ALK基因突变，从而确认是否可在肺癌患者身上适用将EML4‑ALK基因突变作为靶的抗癌剂的肺癌患者筛选方法。

EML4-ALK gene mutation analysis method

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】EML4-ALK基因突变分析方法
本专利技术涉及EML4-ALK突变的检测方法，更详细地，涉及基于血中循环癌细胞的EML4-ALK突变检测用聚合酶链式反应(PCR)引物对、利用巢式(nested)聚合酶链式反应的EML4-ALK突变的检测方法及利用来源于非小细胞肺癌患者的血液的癌细胞来对抗癌剂进行的非小细胞肺癌患者筛选方法。
技术介绍
肺癌在2010年韩国国内产生癌症患者(202053名)中占第四位(10.3％)，是常见于韩国人的癌症。但是，5年生存率为19.7％，与其他癌症相比，预后差。肺癌根据通过显微镜的癌细胞的大小和形态区分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，如此区分非小细胞肺癌和小细胞肺癌时，临床经过和治疗不同。根据2011年发表的中央癌症登记总部资料，在2009年，韩国一年产生192561件癌症，其中的非小细胞肺癌一年男女共产生14300件，非小细胞肺癌占总肺癌产生19685件的72.6％。男女性别比为2.5：1，男性多见(保健福祉部中央癌症登记总部2011年12月29日发表资料)。ALK阳性非小细胞肺癌为通过ALK、EML4这2个基因的融合产生的肺癌，是具有相当于总肺癌患者的4～7％(东方人7％)的EML4-ALK基因突变的患者，据报告，167名的韩国非小细胞肺癌患者中的10名具有EML4-ALK突变(J.KoreanMed.Sci.,27：228-230,2012)。对于上述EML4-ALK突变引起的非小细胞肺癌的靶抗癌剂为辉瑞开发的赛可瑞(XALKORI)(克唑替尼，crizotinib)。2011年8月，通过美国食品药品监督管理局(FDA)由赛可瑞共同被承认雅培的伴随诊断(companiondiagnostics)之后，广泛用于美国肿瘤学界而在临床上得到验证，并成为标准化的基因检查方法。在欧洲也通过CE-IVD检查被承认，并从2011年9月用于医疗现场中，主要用于支援学术研究和新的治疗法的评价。赛可瑞上市之后，非小细胞肺癌的治疗以表皮生长因子受体(EGFR)突变检查之后，根据有无突变，在将易瑞沙(Iressa)或常规的细胞毒性抗癌剂(治疗效果低，副作用大)投药的标准治疗方法中，表皮生长因子受体、EML4-ALK检查之后，选择易瑞沙/赛可瑞/常规的细胞毒性抗癌剂中的治疗方法的方式转换模式。ALK基因突变表示多种形态的基因融合，作为用于将其检测的方法，免疫组织化学(immunohistochemistry)、逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)等可用于临床中，当前，作为用于将克唑替尼(crizotinib)给药的标准伴随诊断测试，利用由美国食品药品监督管理局承认的雅培的VysisALK荧光原位杂交方法，但这种方法存在因难且复杂而测试很多患者时需要很多费用和时间的问题。并且，众所周知，达到解剖学特性(LungCancer84：39-44,2014,CancerCytopathol.Epubaheadofprint2014.4.10)，从而迫切寻求与其相关的对策。另一方面，血中循环癌细胞(CTC，circulatingtumorcell)是指从原发肿瘤组织中脱离出来并沿着血流而流动的少数的肿瘤细胞，根据癌症，每1mL的血液中一个存在有数千个血中循环癌细胞。利用血中循环癌细胞的检查法作为可代替现有的组织检查的强大的技术，具有因低廉的费用、组织检查而减少患者的痛苦和危险，且可通过快速选定靶药物来延长患者的寿命的优点。对此，本专利技术人为了开发用于还可使难以采集肺癌组织的患者也将抗癌剂，例如，克唑替尼(crizotinib)进行投药的基因检查法而锐意努力，最终，开发捕捉以血中循环癌细胞形态存在的肺癌细胞来以高的准确度确认上述血中循环肺癌细胞的EML4-ALK突变的方法，并完成本专利技术。
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的目的在于，提供用于以高的准确度确认基于血中循环癌细胞的EML4-ALK基因突变的EML4-ALK突变检测用聚合酶链式反应引物对。本专利技术的再一目的在于，提供以高的准确度检测EML4-ALK的V1型突变的方法。本专利技术的另一目的在于，提供以高的准确度检测EML4-ALK的V3型突变的方法。本专利技术的还一目的在于，提供利用来源于非小细胞肺癌患者的血液的癌细胞来确认抗癌剂对癌症患者是否有效的癌症患者筛选方法。本专利技术要实现的技术问题不局限于以上提及的技术问题，本专利技术所属
的普通技术人员可从以下记载内容中明确地理解未提及的其他技术问题。用于解决问题的方案为了实现上述技术问题，本专利技术的一实施方式的EML4-ALK基因突变分析方法可包括：从癌症患者身上获取液态活检样品的步骤；从上述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；从分离的上述血中循环癌细胞中分离核糖核酸(RNA)的步骤；将分离的上述核糖核酸作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应的步骤；将在上述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应的步骤；以及利用在上述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型的步骤。在本专利技术的实施例中，上述液态活检样品可以为血液。在本专利技术的实施例中，上述癌症可以为肺癌。在本专利技术的实施例中，上述癌症可以为非小细胞肺癌。在本专利技术的实施例中，分离上述血中循环癌细胞的步骤可在大气压1000至1020hPa下实现。在本专利技术的实施例中，上述生物芯片可以为由牛血清白蛋白(BSA)溶液涂敷的高密度微芯片。在本专利技术的实施例中，上述高密度微芯片可具有尺寸特异性。在本专利技术的实施例中，上述牛血清白蛋白溶液能够以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。在本专利技术的实施例中，上述EML4-ALK基因的突变类型可以为V1型或V3型。在本专利技术的实施例中，上述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的一个可以为正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物，另一个可以为反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物。在本专利技术的实施例中，上述正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可以为选自由SEQIDNO.1、SEQIDNO.3及SEQIDNO.4组成的组中的一个。在本专利技术的实施例中，上述反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物可以为SEQIDNO.2。在本专利技术的实施例中，上述2个巢式引物中的一个可以为正向巢式引物，另一个可以为反向巢式引物。在本专利技术的实施例中，上述正向巢式引物可以为选自由SEQIDNO.1、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4及SEQIDNO.10组成的组中的一个。在本专利技术的实施例中，上述反向巢式引物可以为SEQIDNO.2或SEQIDNO.9。为了实现上述技术问题，在本专利技术的另一实施方式的癌症患者筛选方法中，当通过本专利技术的EML4-ALK基因突变分析方法得到的癌症患者的基因突变与选自由如下组成的组中的一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，包括：/n从癌症患者身上获取液态活检样品的步骤；/n从所述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；/n从分离的所述血中循环癌细胞中分离RNA的步骤；/n将分离的所述RNA作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应的步骤；/n将在所述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于所述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应的步骤；以及/n利用在所述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型的步骤。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170807 KR 10-2017-00995911.一种EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，包括：
从癌症患者身上获取液态活检样品的步骤；
从所述液态活检样品中利用生物芯片来分离血中循环癌细胞的步骤；
从分离的所述血中循环癌细胞中分离RNA的步骤；
将分离的所述RNA作为模板，并利用2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物来执行定量逆转录-聚合酶链式反应的步骤；
将在所述定量逆转录-聚合酶链式反应中产生的产物作为模板，并利用对于所述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物的2个巢式引物来执行巢式聚合酶链式反应的步骤；以及
利用在所述巢式聚合酶链式反应中产生的产物来检测EML-ALK基因的突变类型的步骤。


2.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述液态活检样品为血液。


3.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述癌症为肺癌。


4.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述癌症为非小细胞肺癌。


5.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，分离所述血中循环癌细胞的步骤在大气压1000至1020hPa下实现。


6.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述生物芯片为由牛血清白蛋白溶液涂敷的高密度微芯片。


7.根据权利要求6所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述高密度微芯片具有尺寸特异性。


8.根据权利要求6所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述牛血清白蛋白溶液以0.05至0.15％的浓度进行涂敷。


9.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述EML4-ALK基因的突变类型为V1型或V3型。


10.根据权利要求1所述的EML4-ALK基因突变分析方法，其特征在于，所述2个定量逆转录-聚合酶链式反应用引物中的一个为正向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物，另一个为反向定量逆转录-聚合酶链式反应用引物。


11.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：全炳熙，
申请(专利权)人：西托根有限公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR