一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用技术

本发明专利技术属于生物检测技术领域，具体涉及一种拉莫三嗪衍生物，其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用。所述拉莫三嗪衍生物的结构式如下述式(Ⅰ)所示：

A ramification of lamotrigine, its preparation and application in homogeneous enzyme immunoassay

【技术实现步骤摘要】
一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用
本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种拉莫三嗪衍生物、其制备方法及其在均相酶免疫检测试剂中的应用。
技术介绍
拉莫三嗪(Lamotrigine)的化学结构式如下述式(Ⅳ)所示：拉莫三嗪是一种电压性的钠离子通道阻滞剂，主要用于抗癫痫治疗，也可用于治疗合并有Lennox-Gastaut综合征的癫痫发作。药代动力学研究表明：拉莫三嗪在肠道内迅速而完全地被吸收，口服给药后在2.5小时达到血浆峰浓度，当单次最高给药剂量达450mg时，药代动力学曲线仍呈线性，稳态的最高血药浓度在个体之间差异颇大，但在同一个体浓度的差异很小，血浆蛋白结合率约为55％，分布容积为0.92-1.22L/mg。在拉莫三嗪作为单药治疗的试验中，不良反应包括：头痛、疲倦、皮疹、恶心、头晕、嗜睡和失眠等。在标准的抗癫痫药物治疗方案中添加拉莫三嗪时，不良反应包括：复视、视力模糊、结膜炎、头昏、瞌睡、头痛、疲倦、胃肠道紊乱、攻击行为、共济失调、焦虑、精神混乱及血液学异常等。拉莫三嗪代谢物主要随尿液排出体外。因此，检测使用拉莫三嗪治疗的患者血液、尿液等生物样本中拉莫三嗪的含量能为临床个体化精准用药提供重要依据。目前，检测拉莫三嗪常用的方法主要有：气相色谱法、气质联用法、液相色谱法、高效液相色谱法等，这些仪器分析方法虽然灵敏度较高，检测结果精密度高、准确性好，但是存在样品的前处理较繁琐、测定时间较长、需要配备专门的仪器设备，操作流程复杂，单个样品的检测时间较长，不能快速提供检测结果等缺陷，不适用于临床上大批量样品的检验。因此，研发一种高通量、快速化、高灵敏度、结果精确、操作简便、成本低廉的拉莫三嗪检测方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种用于生物样本中拉莫三嗪检测的拉莫三嗪衍生物及其制备方法，使用该拉莫三嗪衍生物制备出免疫原性强的拉莫三嗪免疫原，从而免疫实验动物得到高效价的抗拉莫三嗪特异性抗体；同时，使用该拉莫三嗪衍生物制备得到拉莫三嗪酶标偶联物。利用该抗体和酶标偶联物制备的拉莫三嗪均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对拉莫三嗪高通量、快速化的检测。均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了防止葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物与酶的底物(葡萄糖-6-磷酸)及辅酶(氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)发生反应，必须将酶标偶联物与底物分开放置，不能混合。所以传统的均相酶免疫检测试剂是将底物、辅酶与半抗原特异性抗体混合在一起制成R1试剂，而将葡萄糖-6-磷酸脱氢-半抗原酶标偶联物单独加入R2试剂中的。也就是说，传统的均相酶免疫检测试剂在使用前底物与辅酶是混合在一起的。然而，如果在使用前操作者不慎将少量R2试剂混入R1试剂中，或者全自动生化分析仪运行过程中存在携带污染情况，就会使酶和底物提前发生反应，而且在底物和辅酶充足的情况下，反应会持续进行，导致底物被大量消耗，同时氧化态的辅酶会被大量还原成还原态的辅酶，从而导致检测试剂本底信号持续升高，严重影响检测结果的准确度，甚至导致试剂完全报废。本专利技术改进了传统均相酶免疫试剂的配方，将辅酶添加到R2试剂中，而R1试剂中只添加抗体与底物，不再添加辅酶，这样即使使用前有少量R2试剂混入R1试剂中，反应也会在辅酶消耗完后立刻终止。因此本专利技术可以有效避免试剂使用前R1试剂与R2试剂发生交叉污染导致的本底反应信号升高，避免了试剂浪费，提高了检测准确度。本专利技术的拉莫三嗪均相酶免疫检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低拉莫三嗪检测成本，有利于临床推广使用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一、提供一种拉莫三嗪衍生物，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：二、提供一种上述的拉莫三嗪衍生物的制备方法，所述制备方法的合成路线如下：具体的制备步骤如下：a.合成拉莫三嗪-酸衍生物称取5g化合物1、3.35g化合物2共同溶解于50mL的THF中制成反应液，然后将反应液加热回流72小时，反应结束后去除溶剂，然后将剩余物通过硅胶柱进行纯化，得到拉莫三嗪-酸衍生物。b.合成拉莫三嗪衍生物称取2g拉莫三嗪-酸衍生物溶解于40mLDCM中，然后加入1.25g化合物3、1gTEA及3.1gHATu配制成反应混合液，然后将反应混合液在室温下搅拌过夜，反应结束后将反应混合液用纯化水和卤水冲洗，然后通过Na2SO4干燥、浓缩处理，再将浓缩产物通过硅胶柱进行纯化，得到拉莫三嗪衍生物。三、提供一种拉莫三嗪免疫原，由上述的拉莫三嗪衍生物与人纤维蛋白原连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：四、提供一种上述的拉莫三嗪免疫原的制备方法，包括以下步骤：a.称取2.0-5.0g磷酸二氢钾、3.0-6.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-2.5g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.0-9.0，制成缓冲溶液A；b.称取3.0-6.0mg人纤维蛋白原，0-8℃下溶解于3.0-6.0ml上述缓冲溶液A中，制成载体溶液；c.称取3.0-8.0mg上述式(Ⅰ)所示的拉莫三嗪衍生物，0-8℃下溶解于300-800μl上述缓冲溶液A中，制成拉莫三嗪衍生物溶液；d.当上述拉莫三嗪衍生物溶液刚变澄清时，将其逐滴加入上述载体溶液中，然后将此混合溶液在-18～-2℃下搅拌3-10小时；e.将反应后的上述混合溶液用上述缓冲溶液A进行透析，透析后所得溶液即为拉莫三嗪免疫原溶液，在拉莫三嗪免疫原溶液中加入质量分数0.05-0.20％的NaN3，于-20℃下储存。五、提供一种抗拉莫三嗪特异性抗体，所述抗体由上述的拉莫三嗪免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马中的一种。六、提供一种上述的抗拉莫三嗪特异性抗体的制备方法，包括以下步骤：a.将上述式(Ⅱ)所示的拉莫三嗪免疫原用PBS缓冲液稀释至2.0-5.0mg/ml，得到抗原溶液，然后将2.0-5.0ml所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；b.1-4周后，再用2.0-5.0ml相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合，对上述实验动物注射一次，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗拉莫三嗪特异性抗体。七、提供一种拉莫三嗪酶标偶联物，由上述的拉莫三嗪衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述式(Ⅲ)所示：八、提供一种上述的拉莫三嗪酶标偶联物的制备方法，包括以下步骤：a.称取1.0-3.0g磷酸二氢钾、1.0-5.0g磷酸氢二钠、7.5-15.0g氯化钠、1.0-3.0g氯化镁，共同溶解于1.0-2.5L去离子水中，调节pH至7.0-9.0，制成缓冲溶液B；b.称取3.0-6.0mg葡萄糖-6本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种拉莫三嗪衍生物，其特征在于，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种拉莫三嗪衍生物，其特征在于，其结构式如下述式(Ⅰ)所示：





2.一种如权利要求1所述的拉莫三嗪衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的合成路线如下：





3.一种拉莫三嗪免疫原，其特征在于，由权利要求1所述的拉莫三嗪衍生物与人纤维蛋白原连接而成，其结构式如下述式(Ⅱ)所示：





4.一种如权利要求3所述的拉莫三嗪免疫原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将权利要求1所述的拉莫三嗪衍生物溶解于pH为7.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液中，制成拉莫三嗪衍生物溶液；
b.将人纤维蛋白原溶解于pH为7.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液中制成载体溶液；
c.将拉莫三嗪衍生物溶液与载体溶液混合反应完全后透析即得拉莫三嗪免疫原溶液。


5.一种抗拉莫三嗪特异性抗体，其特征在于，由权利要求3所述的拉莫三嗪免疫原免疫实验动物后产生，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，所述实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马。


6.一种如权利要求5所述的抗拉莫三嗪特异性抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.将权利要求3所述的拉莫三嗪免疫原用PBS缓冲液稀释，得到抗原溶液，然后将所述抗原溶液与等量弗氏完全佐剂混合后注射实验动物；
b.1-4周后，再用相同的抗原溶液与等量弗氏不完全佐剂混合后注射实验动物，之后每隔1-4周注射一次，共计注射3-8次；
c.对免疫后的实验动物取血，分离纯化抗血清，得到抗拉莫三嗪特异性抗体。


7.一种拉莫三嗪酶标偶联物，其特征在于，由权利要求1所述的拉莫三嗪衍生物与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶连接而成，其结构式如下述...

【专利技术属性】
技术研发人员：林观样，胡卢丰，周子晔，虞留明，
申请(专利权)人：苏州博源医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32