本发明专利技术公开了一种羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。该检测试剂盒中，酶标板预包被了细粒棘球蚴鸡尾酒抗原；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。使用本发明专利技术所提供的检测试剂盒可以快速检测羊血清中的包虫抗体，操作简单，耗时短，敏感性高，特异性好，便于同时检测大量样本。本发明专利技术所提供的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒在包虫病抗体水平检测、流行病学调查中具有重要的应用价值。
An ELISA kit for detection of hydatidosis and its application
【技术实现步骤摘要】
一种检测羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术属于酶联免疫吸附检测领域，涉及一种羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其制备方法与应用。
技术介绍
包虫病是由棘球绦虫的幼虫寄生于人或动物体内引起的人兽共患病，我国将其列为二类动物疫病，OIE将其列为B类动物疾病。棘球蚴可寄生在宿主体内的任何器官，压迫周围组织造成萎缩和功能障碍，蚴囊破裂还会引起继发性感染或休克，甚至死亡。目前已确认的棘球属绦虫有5种，其中由细粒棘球绦引起的囊型包虫病集中在我国西北畜牧大省，以绵羊、牛、猪感染尤为严重，对公共卫生安全和畜牧业生产造成威胁。目前诊断包虫病的“金标准”是剖检法，该法对可疑病灶或包囊有时无法鉴定。我国相关的农业行业标准包括间接血球凝集实验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应。间接血凝试验是以细胞为载体与抗原抗体特异性结合，准确性高，耗时少，易受环境影响，临床使用性差；聚合酶链式反应特异性好、灵敏度、重复性好，但对实验室硬件条件要求较高，基层兽医实验室难以推广。酶联免疫吸附法是近年来检测包虫病较为常用的免疫学方法之一。具有快速、简便、费用低廉、可同时检测大量样本等优点，被广泛应用于包虫病的实验室诊断和群体流行病学调查。抗原B（AntigenB,AgB）是细粒棘球蚴囊液的主要抗原成分，占粗抗原的90%，被认为是免疫诊断试验中具有高度敏感性和特异性的抗原。其中EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4是血清检测的主要反应亚基。细粒棘球蚴-原头蚴钙结合蛋白1（EPC1）对囊性包虫病具有很强的诊断潜力。故本专利技术通过利用EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成细粒棘球蚴鸡尾酒抗原，建立一种操作简便、快速、特异的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒。
技术实现思路
为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。上述抗体检测试剂盒中，所述酶标板材质为96孔固相酶标板NUNC-468667。上述抗体检测试剂盒中，细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中表达的EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原的浓度比为2:1:2:1。本专利技术还提供了上述羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备：以细粒棘球蚴cDNA文库为模版，针对EPC1、EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-EPC-1、pET28a-EgAgB1、pET28a-EgAgB2和pET28a-EgAgB4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到EPC1重组蛋白、EgAgB1重组蛋白、EgAgB2重组蛋白和EgAgB4重组蛋白。2）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备：将囊液蛋白用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5μg/mL的抗原包被液，每孔100μL，2-8℃包被16h后洗板；然后每孔加入200μL封闭液，37℃、湿度30-40%封闭2h，37℃、湿度30-40%恒温干燥2h。所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原，终浓度分别为2.8mg/mL、1.4mg/mL、2.8mg/mL和1.4mg/mL；3）阳性对照液的制备：试验用羊攻虫270日血清1:100倍稀释。4）阴性对照液的制备：健康绵羊血清1:100倍稀释。5）酶标记物浓缩液的制备：辣根过氧化物酶标记的HRP-MouseAnti-goatIgG1:30000倍稀释。6）酶标记物稀释液的制备：0.01MpH7.4的PBST溶液。7）样品稀释液的制备：0.01MpH7.4的PBS溶液。8）底物A液的制备：含0.08%过氧化脲、0.025%PEG-2000、3.58%十二水合磷酸氢二钠、0.96%一水合柠檬酸水溶液，调pH值至7.4。9）底物B液的制备：含1.03%一水合柠檬酸、0.04%TMB、0.0008%硫代硫酸钠、0.1%光稳定剂292、3%DMF水溶液，调pH值至5.0。10）终止液的制备：含0.1%10%SDS、5.56%硫酸水溶液。11）洗涤液的制备：0.25MpH7.4的PBST溶液。其中，步骤1）中所述EPC1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列1-2所示，EPC1重组抗原核酸序列可如序列表的序列3所示；EgAgB1重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列4-5所示，EgAgB1重组抗原核酸序列可如序列表的序列6所示；EgAgB2重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列7-8所示，EgAgB2重组抗原核酸序列可如序列表的序列9所示；EgAgB4重组抗原制备时所用的引物如序列表的序列10-11所示，EgAgB4重组抗原核酸序列可如序列表的序列12所示。本专利技术还提供了上述羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒在包虫病检测中的应用。上述抗体检测试剂盒中采用间接ELISA法，待检样品中的包虫病特异性抗体与包被板上抗原结合，加入酶标记物，催化底物显色，显色的深浅与样本中的抗体含量成正比，显色深，含量多，显色浅，含量少。本专利技术利用细粒棘球蚴鸡尾酒抗原建立的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒具有较高的敏感性和特异性，且操作简单、快速，便于同时检测大量样本，实用性较强。在羊包虫的抗体水平检测、流行病学调查方面提供了重要方法。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备1、羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的组成羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒由细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板组成。2、羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备A.引物设计根据GeneBank中EPC-1（登录号AF481884）、EgAgB1（登录号Z26336.1）、EgAgB2（登录号JN050887.1）、EgAgB4（登录号AY871031.1）序列设计引物：EPC-1-F：GGATCCGCCGTACTATGAGTCTTCAEPC-1-R：AAGCTTTCTAGGCTTAATTCGCCGTCEgAgB1-F：GG本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。/n
【技术特征摘要】
1.羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，包括细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板、阳性对照液、阴性对照液、酶标记物浓缩液、酶标记物稀释液、样本稀释液、底物A液、底物B液、终止液、洗涤液、血清稀释板；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原是由EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原组成。
2.权利要求1所诉羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，酶标板材质为96孔固相酶标板NUNC-468667。
3.权利要求1所述的羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒，细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中表达的EPC1重组抗原、EgAgB1重组抗原、EgAgB2重组抗原和EgAgB4重组抗原的浓度比为2:1:2:1。
4.权利要求1所诉羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
1）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原的制备：以细粒棘球蚴cDNA文库为模版，针对EPC1、EgAgB1、EgAgB2和EgAgB4基因序列设计特异性引物，通过PCR扩增目的片段并克隆至表达载体pET28a，将成功构建的重组表达质粒pET28a-EPC-1、pET28a-EgAgB1、pET28a-EgAgB2和pET28a-EgAgB4转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导表达，经亲和层析和分子筛层析高度纯化后得到EPC1重组蛋白、EgAgB1重组蛋白、EgAgB2重组蛋白和EgAgB4重组蛋白；
2）细粒棘球蚴鸡尾酒抗原预包被酶标板的制备：将鸡尾酒抗原用碳酸盐缓冲液稀释成浓度为5μg/mL的抗原包被液，每孔100μL，2-8℃包被16h后洗板；然后每孔加入200μL封闭液，37℃、湿度30-40%封闭2h，37℃、湿度30-40%恒温干燥2h；所述细粒棘球蚴鸡尾酒抗原中由EPC1重组抗原、EgA...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘河冰，温凯，杨柳，李蓉蓉，马立才，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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