一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及医学免疫领域，特别涉及一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒。该试剂盒包括：样品稀释液、偶联有MCV抗原的磁微粒、酶结合物和发光底物；所述酶结合物由酶标记的鼠抗人IgG抗体和酶结合物稀释液组成；所述样品稀释液为含0.5％‑2％牛血清白蛋白、0.5％‑1％Casein蛋白质、100‑500ng/ml嗜异性抗体阻断剂和0.1％‑5％金属螯合剂的pH7.4的0.05M磷酸盐缓冲液。本发明专利技术所述试剂盒灵敏度高、特异性好、线性范围宽，且稳定性好，使用方便。此外，本试剂盒可搭载自动化系统操作简单，通量大；采用磁微粒平台，使用面较广，成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒
本专利技术涉及医学免疫
，尤其涉及一种检测突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒。
技术介绍
类风湿性关节炎(RA)是一种以关节的慢性炎症为主的自身免疫性疾病，致残率很高。瓜氨酸相关自身抗体在关节腔的沉积是RA滑膜炎持续存在的主要原因，此外，还包括遗传因素、环境因素等。RA的诊断目前还采用美国风湿病学会(ARA)修订的RA诊断分类标准(1987年)，其中类风湿因子(RF)是较常见的血清学指标，RF的IgM型在RA的诊断中特异性不高,在其它自身免疫病、感染及部分老年人群中也可检测出来。目前抗瓜氨酸合成蛋白(ACPAS)在类风湿关节炎中成为敏感和特异的血清学标志物，在RA实验室诊断中比RF更为优越，ACPA家族包括抗核周因子抗体(APF)、抗角蛋白抗体(AKA)、抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)、抗突变性瓜氨酸波形蛋白抗体(抗MCV)等。目前多种瓜氨酸合成蛋白成员在RA关节滑液中检测出，部分已广泛应用于临床诊断。抗CCP抗体已成为诊断类风湿关节炎(RA)的特异性血清学标志物,而且抗CCP有显著的预测价值，就是在疾病的早期阶段甚至在临床症状出现之前就可检测出。然而最近几年在RA患者中检测出了其他瓜氨酸化蛋白如瓜氨酸波形蛋白、瓜氨酸纤维蛋白,表明瓜氨酸对RA的特异性抗体是必不可少的抗原组成。最新研究表明，抗MCV抗体与抗CCP抗体有相似的诊断性能,并且优于抗CCP抗体的ELISA法。抗MCV抗体检测的诊断与抗CCP抗体略不同,尤其在RF、抗CCP血清阴性的RA患者中、抗MCV抗体可以阳性。目前，抗MCV抗体检测有ELISA法、胶体金法等。ELISA法需要专用设备，反应时间比较长，检测步骤繁杂；胶体金法灵敏度和特异性较低，应用受到限制。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种检测突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒。该试剂盒灵敏度高、特异性好、线性范围宽，且稳定性好，使用方便。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供了一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒，包括：样品稀释液、偶联有MCV抗原的磁微粒、酶结合物和发光底物；所述酶结合物由酶标记的鼠抗人IgG抗体和酶结合物稀释液组成；所述样品稀释液为含0.5％-2％牛血清白蛋白、0.5％-1％Casein蛋白质、100-500ng/ml嗜异性抗体阻断剂和0.1％-5％金属螯合剂的pH7.4的0.05M磷酸盐缓冲液。一些实施方案中，所述嗜异性抗体阻断剂为HBR(HeterophilicBlockingReagent)所述金属螯合剂为EDTA-2Na或EDTA-2K。一些实施方案中，所述样品稀释液为含0.5％-2％牛血清白蛋白、0.5％-1％Casein蛋白质、100-500ng/ml嗜异性抗体阻断剂HBR和0.1％-5％EDTA-2Na或0.1％-5％EDTA-2K的pH7.4、0.05M磷酸盐缓冲液。一些具体实施例中，所述样品稀释液为含1％牛血清白蛋白、1％Casein蛋白质、嗜异性抗体阻断剂HBR300ng/ml及3％金属螯合剂(EDTA-2Na或EDTA-2K)。嗜异性抗体阻断剂HBR(HeterophilicBlockingReagent)能够特异性结合人体内嗜异性抗体，阻止嗜异性抗体干扰检测。在一个具体实施例中，本专利技术通过精密性测试实验发现，与其他样品稀释液相比，采用本专利技术试剂盒中样品稀释液对待测样本进行处理后，可有效地提高检测的特异性和精密度。一些实施方案中，所述磁微粒的粒径为0.5um-10um。本专利技术采用的磁微粒表面的活性基团为羧基(—COOH)、氨基(—NH2)或苯甲磺酰基。实际制备时，其活性基团优选采用羧基(—COOH)，羧基基团的磁微粒在化学交联剂EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)作用下，与MCV抗原的氨基基团形成酰胺键而共价结合。一些实施方案中，所述偶联有MCV抗原的磁微粒由酪蛋白和不含蛋白酶的牛血清白蛋白经两步法封闭制备得到。一些实施方案中，所述偶联有MCV抗原的磁微粒的制备方法为：取0.01M、pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)磁珠缓冲液反复吹打磁珠，置于磁珠分离器上，弃上清后添加碳二亚胺活化液，室温反应1h；然后加入MCV抗原进行偶联过夜；偶联结束后，至于磁珠分离器上弃上清，加入乙醇胺溶液进行封闭30min～1h；磁珠也置于分离器上，弃上清，先加入封闭液1混匀，弃上清，重复3-5次后，用封闭液2进行定容，2-8℃保存；所述封闭液1为含0.5％-3％酪蛋白、0.1％-1％Tetronic1307的pH8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液，封闭液2为含0.5-2％无蛋白酶的牛血清白蛋白、0.3％-0.5％组蛋白乙酰化酶p300抑制剂的pH8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液。所述酶标记的鼠抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶或碱性磷酸标记的鼠抗人IgG抗体。所述酶结合物稀释液为含有0.5％-3％牛血清白蛋白、0.1％-2％曲拉通X-100的pH为8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液。一些具体实施例中，所述封闭液1为含2％酪蛋白、0.5％Tetronic1307的pH8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液，封闭液2为含1％无蛋白酶的牛血清白蛋白、0.5％组蛋白乙酰化酶p300抑制剂的pH8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液；所述酶标记的鼠抗人IgG抗体为辣根过氧化物酶或碱性磷酸标记的鼠抗人IgG抗体。所述酶结合物稀释液为含有1％牛血清白蛋白、0.5％曲拉通X-100的pH为8.0的0.01MTris-Nacl缓冲液。本专利技术提供的试剂盒中，酶结合物采用的酶为辣根过氧化物酶(HRP)时，化学发光底物采用鲁米诺或异鲁米诺；若酶采用碱性磷酸酶(ALP)，则化学发光底物采用3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)。一些实施方案中，发光底物包括A液和B液，其中A液为双氧水，B液为鲁米诺溶液或鲁米诺衍生物溶液，A液和B液的体积比为1:1。本专利技术提供的试剂盒还包括MCV校准品溶液，所述MCV校准品溶液由MCV抗体和校准品稀释液组成，所述标准品稀释液由三羟甲基甲胺基丙磺酸(TAPS)、酪蛋白、小牛血清、组蛋白乙酰化酶p300抑制剂、甲基异噻唑啉酮MIT-50防腐剂组成。考核37℃加速破坏稳定性14天及2-8℃稳定性24个月，浓度值变幅小于10％，与传统的固态标准品相比，稳定性相当甚至更优，且使用便捷性优于固态校准品。一些具体实施例中，所述MCV校准品溶液的浓度为0～2000U/ml。本专利技术利用磁微粒化学发光方法检测人抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体，检测原理为：通过磁微粒包被MCV抗原，结合人血清、血浆中的MCV抗体，再与辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸酶(AP)标记的鼠抗人IgG抗体结合形成复合本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，包括：样品稀释液、偶联有MCV抗原的磁微粒、酶结合物和发光底物；所述酶结合物由酶标记的鼠抗人IgG抗体和酶结合物稀释液组成；所述样品稀释液为含0.5％-2％牛血清白蛋白、0.5％-1％Casein蛋白质、100-500ng/ml嗜异性抗体阻断剂和0.1％-5％金属螯合剂的pH7.4的0.05M磷酸盐缓冲液。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒，其特征在于，包括：样品稀释液、偶联有MCV抗原的磁微粒、酶结合物和发光底物；所述酶结合物由酶标记的鼠抗人IgG抗体和酶结合物稀释液组成；所述样品稀释液为含0.5％-2％牛血清白蛋白、0.5％-1％Casein蛋白质、100-500ng/ml嗜异性抗体阻断剂和0.1％-5％金属螯合剂的pH7.4的0.05M磷酸盐缓冲液。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为含0.5％-2％牛血清白蛋白、0.5％-1％Casein蛋白质、100-500ng/ml嗜异性抗体阻断剂HBR和0.1％-5％EDTA-2Na或0.1％-5％EDTA-2K的pH7.4、0.05M磷酸盐缓冲液。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的粒径为0.5um-10um。


4.根据权利要求1所述的是试剂盒，其特征在于，所述磁微粒的表面修饰有-COOH、-NH2、苯甲磺酰基或-SH基团。


5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联有MCV抗原的磁微粒由酪蛋白和不含蛋白酶的牛血清白蛋白经两步法封闭制备得到。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联有MCV抗原的磁微粒的制备方法为：
取0.01M、pH6.0的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)磁珠缓冲液反复吹打磁珠，置于磁珠分离器上，弃上清后添加碳二亚胺活化...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，于林，李双法，丁蒙蒙，刘珂，毛宁宇，付光宇，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41