生成大规模平行测序的DNA文库的改进的方法和试剂盒技术

公开了一种生成大规模平行测序文库的方法，其包括以下步骤：a)提供基本WGADNA文库(pWGAlib)，所述基本WGA DNA文库包括含有WGA文库通用序列衔接子的片段；b)使用第一引物(1PR)对pWGAlib进行单个PCR，所述第一引物(1PR)从5'到3'包括第一测序衔接子(1PR5SA)和第一引物3'区段(1PR3S)，所述第一引物3'区段(1PR3S)与所述WGA文库通用序列衔接子的反向互补序列杂交；c)使用第二引物(2PR)对步骤b)的产物进行单个PCR，所述第二引物(2PR)从5'到3'包括与1PR5SA不同的第二测序衔接子(2PR5SA)和第二引物3'区段(2PR3S)，所述第二引物3'区段(2PR3S)与WGA文库通用序列衔接子的反向互补序列杂交；d)使用包含所述1PR5SA的第三引物和包含所述2PR5SA的第四引物通过PCR扩增步骤c)的产物。

Improved methods and kits for generating large-scale parallel sequenced DNA libraries

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生成大规模平行测序的DNA文库的改进的方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请要求于2017年7月21日提交的欧洲专利申请第17182693.6号的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
本专利技术涉及由全基因组扩增产物(WGA)生成用于全基因组测序的大规模平行测序文库的方法和试剂盒。特别地，该方法可以有利地应用于确定性限制性位点(DeterministicRestriction-Site)，全基因组扩增(DRS-WGA)DNA产物。该文库可有利地用于低通全基因组测序和全基因组拷贝数分析(genome-widecopy-numberprofiling)。
技术介绍
对于单细胞，为了获得更多DNA以简化和/或使得可以进行不同类型的遗传分析(包括测序、SNP检测等)，进行全基因组扩增(WGA)是有用的。使用基于确定性限制性位点的LM-PCR(例如WO/2000/017390中所述)进行的WGA是本领域已知的(下文中简称为DRS-WGA)。基于LM-PCR的DRS-WGA商业试剂盒(Ampli1TMWGA试剂盒，Silico本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生成大规模平行测序文库的方法，包括以下步骤：/na.提供基本WGA DNA文库(pWGAlib)，所述基本WGA DNA文库(pWGAlib)包括含有已知的5'序列区段(5SS)、中间序列区段(MSS)和与所述已知的5'序列区段反向互补的已知的3'序列区段(3SS)的片段，所述已知的5'序列区段(5SS)包括WGA文库通用序列衔接子，所述中间序列区段(MSS)至少包括插入区段(IS)，所述插入区段(IS)与WGA之前的原始未扩增DNA的DNA序列对应，所述中间序列区段(MSS)任选地另外包括侧翼5'中间区段(F5)和/或侧翼3'中间区段(F3)；/nb.使用至少一种第一引物(1PR)对...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170721 EP 17182693.61.一种生成大规模平行测序文库的方法，包括以下步骤：
a.提供基本WGADNA文库(pWGAlib)，所述基本WGADNA文库(pWGAlib)包括含有已知的5'序列区段(5SS)、中间序列区段(MSS)和与所述已知的5'序列区段反向互补的已知的3'序列区段(3SS)的片段，所述已知的5'序列区段(5SS)包括WGA文库通用序列衔接子，所述中间序列区段(MSS)至少包括插入区段(IS)，所述插入区段(IS)与WGA之前的原始未扩增DNA的DNA序列对应，所述中间序列区段(MSS)任选地另外包括侧翼5'中间区段(F5)和/或侧翼3'中间区段(F3)；
b.使用至少一种第一引物(1PR)对基本WGADNA文库进行单个PCR循环，所述第一引物(1PR)至少包括第一引物5'区段(1PR5S)和第一引物3'区段(1PR3S)，所述第一引物5'区段(1PR5S)包含至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)，所述第一引物3'区段(1PR3S)与所述已知的3'序列区段(3SS)杂交，从而获得第一引物延伸的WGADNA文库；
c.使用至少一个第二引物(2PR)对所述第一引物延伸的WGADNA文库进行单个PCR循环，所述第二引物(2PR)包括第二引物5'区段(2PR5S)和第二引物3'区段(2PR3S)，所述第二引物5'区段(2PR5S)包含与所述至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)不同的至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)，所述第二引物3'区段(2PR3S)与所述已知的3'序列区段(3SS)杂交，从而获得第一引物和第二引物延伸的WGADNA文库；
d.使用至少一个包含所述第一测序衔接子(1PR5SA)的第三引物(3PR)和至少一个包含所述第二测序衔接子(2PR5SA)的第四引物(4PR)，通过PCR扩增所述第一引物和第二引物延伸的WGADNA文库，从而获得扩增的第一引物和第二引物延伸的WGADNA文库。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一种第一引物(1PR)在第一引物5'区段(1PR5S)的3'位置和第一引物3'区段(1PR3S)的5'位置中还包含至少一个读段测序引物序列(1PRSEQ)。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一引物5'区段(1PR5S)在至少一个第一测序衔接子(1PR5SA)的3'位置和第一引物3'区段(1PR3S)的5'位置中还包含至少一个第一测序条形码(1PR5BC)，和/或所述第二引物5'区段(2PR5S)在至少一个第二测序衔接子(2PR5SA)的3'位置和第二引物3'区段(2PR3S)的5'位置中还包含至少一个第二测序条形码(2PR5BC)。


4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，还包括在步骤b之后纯化所述第一引物延伸的WGADNA文库的步骤，和/或还包括在步骤c之后纯化所述第一引物和第二引物延伸的WGADNA文库的步骤，和/或还包括在步骤d之后纯化所述扩增的第一引物和第二引物延伸的WGADNA文库的步骤。


5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，所述WGA文库通用序列衔接子是DRS-WGA文库通用序列衔接子或MALBAC文库通用序列衔接子。


6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述WGA文库通用序列衔接子是DRS-WGA文库通用序列衔接子。


7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述DRS-WGA文库通用序列衔接子是SEQIDNO:50，所述MALBAC文库通用序列衔接子是SEQIDNO:51。


8.一种用于低通全基因组测序的方法，包括以下步骤：
-提供根据权利要求3至7中任一项所述的方法获得的多个条形码化的大规模平行测序文库，并使用不同测序条形码(BC)池化获得的样品；
-对池化的文库进行测序。


9.根据权利要求8所述的用于低通全基因组测序的方法，其中，使用不同的测序条形码(BC)池化样品的步骤还包括以下步骤：
-对每个所述条形码化的大规模平行测序文库中的DNA进行定量；
-对所述条形码化的大规模平行测序文库的量进行标准化。


10.一种大规模平行测序文库制备试剂盒，包括：
-至少一种第一引物(1PR)，所述第一引物(1PR)至少包括第一引物5'区段(1PR5S)和第一引物3'区段...

【专利技术属性】
技术研发人员：瓦伦蒂娜·德尔莫纳科，尼科洛·马纳雷西，热尼·布松，保拉·托诺尼，
申请(专利权)人：美纳里尼硅生物系统股份公司，
类型：发明
国别省市：意大利;IT