单碱基连续延伸流式靶向测序法制造技术

本发明专利技术公开了一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，该方法利用含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段、引物、微球、核酸聚合酶、荧光标记的ddNTP、核糖3'‑OH被保护的荧光标记的dNTP、核糖3'‑OH被保护的dNTP、核糖3'‑OH去保护剂等，通过引物的单碱基延伸，得到了一系列适用于流式细胞仪检测核酸碱基序列的测序微球，将这些测序微球进一步经流式细胞仪进行检测，可以得到待测核酸片段的碱基序列。与现有测序法相比，本发明专利技术具有简洁、准确及数据易解读等显著优点，能广泛用于基因检测、微生物检查、遗传学、外显子、单核苷酸多态性(SNP)、基因组学和蛋白质组学等核酸测序领域。

Single base continuous extended flow targeted sequencing

【技术实现步骤摘要】
单碱基连续延伸流式靶向测序法
本专利技术涉及一种单碱基连续延伸流式靶向测序法，尤其涉及一种适用于流式细胞仪检测的测序微球的制备方法以及采用该测序微球检测核酸碱基序列的方法，属于基因测序

技术介绍
基因组携带了生命个体的全部遗传信息，基因测序不但能够加深对疾病尤其是恶性肿瘤的分子机制理解，而且在指导靶向给药方面也发挥着重要作用。人类基因组学计划完成后，基因测序技术的发展更加迅猛，在临床实践和基础研究中的应用更加广泛。目前，核酸测序法已发展至三代，从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年以illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的第二代测序（next-generationsequencing，NGS），到以SMRT、Nanopore法为代表的第三代测序，这些测序法虽然在不断地提高基因测序的效率和准确性，但仍然存在操作复杂和数据不易解读(如：基因结构重排和重复区域)等问题，制约了其大规模临床应用。流式细胞技术是利用流式细胞仪对单个细胞或颗粒进行多本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.单碱基连续延伸流式靶向测序法，其特征是包括以下步骤：/n(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；/n(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；/n(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；/n(4)将上一步与核糖3'-OH...

【技术特征摘要】
1.单碱基连续延伸流式靶向测序法，其特征是包括以下步骤：
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)将包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液混合，所得混合物进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(4)将上一步与核糖3'-OH被保护的dNTP混合后进行孵育的微球进行洗涤，再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮上一步的微球，将微球分为两份，其中一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP混合，所得混合物进行孵育；另一份微球与核酸聚合酶、缓冲液、荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合，所得混合物进行孵育；
(6)不断重复上述（4）和（5）的步骤，测序待测核酸片段n个碱基共需连续制备n群微球，共得到与荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP混合后进行孵育的n群微球；
(7)如果利用上述步骤（6）的n群微球无法检测出所有的碱基，则替换步骤（3）和（5）的荧光标记的ddNTP或/和核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6）继续制备微球，共得到4×n或2×n群微球；
(8)将步骤（6）和（7）中得到的4×n、或2×n、或n群微球洗涤、悬浮后，上样流式细胞仪进行检测，即可得到待测核酸片段的碱基序列。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP为荧光标记的ddATP、ddGTP、ddCTP和ddUTP/ddTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP为核糖3'-OH被保护的荧光标记的dATP、dGTP、dCTP和dUTP/dTTP中的至少一种；
优选的，所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、dTTP/dUTP、dGTP和dCTP的混合物；
优选的，微球上包被的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物时，步骤（2）中加入的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段；微球上包被的是含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段时，步骤（2）中加入的是引导待测核酸片段合成的修饰单向引物。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：所述荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP被下述任意一种或多种的荧光物质进行标记：异硫氰酸荧光素、AlexaFluor610、AlexaFluor488、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor700、菁染料Cy5、德克萨斯红、菁染料Cy3、菁染料Cy7、羟基荧光素、萤光黄、菁染料Cy5.5、罗丹明110、ROX、罗丹明6G、TAMRA。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是：步骤（3）和（5）中加入任意两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，得到n群微球，然后将步骤（3）和（5）中的两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP替换为另两种荧光标记的ddNTP或核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，更换容器，采用步骤（2）-（6），得到n群微球，共得2n群微球。


5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)将引导待测核酸片段合成的修饰单向引物或含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段包被在微球表面，得包被微球；
(2)容器Ⅰ中加入步骤（1）得到的包被微球、含待测核酸片段互补序列的单链核苷酸片段或引导待测核酸片段合成的修饰单向引物、缓冲液，混匀，进行孵育杂交；
(3)缓冲液洗涤、悬浮微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅱ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅱ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核糖3'-OH被保护的荧光标记的dNTP，进行孵育，容器Ⅱ中所得测序微球记为A1；所述核糖3'-OH被保护的dNTP为核糖3'-OH被保护的dATP、核糖3'-OH被保护的dTTP/dUTP、核糖3'-OH被保护的dGTP和核糖3'-OH被保护的dCTP；
(4)洗涤容器Ⅰ中微球后，容器Ⅰ中再加入核糖3'-OH去保护剂，混合均匀；
(5)缓冲液洗涤、悬浮容器Ⅰ中的微球，留存部分微球在容器Ⅰ中，另一部分微球从容器Ⅰ中移至容器Ⅲ中，容器Ⅰ中加入核酸聚合酶、缓冲液、核糖3'-OH被保护的dNTP，进行孵育；容器Ⅲ中加入核酸聚合酶、缓冲液、两种荧光标记的ddNTP或两种核...

【专利技术属性】
技术研发人员：兰文军，张静，胡岳，
申请(专利权)人：齐鲁工业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37