构建测序文库制造技术

本发明专利技术提供了制备测序文库的方法和成分。该方法和成分能够使用多重PCR，制备二代测序文库，并减少引物二聚体的形成。

Construction of sequencing Library

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】构建测序文库
本专利技术涉及测序文库的构件，尤其涉及一种采用多重PCR构建二代测序文库的技术，该技术同时可减少引物二聚体的形成。
技术介绍
二代测序(NGS)或大规模平行测序所使用的文库是由多重聚合酶链反应(PCR)构建而成的。测序文库的构建过程会显著影响测序数据的质量和输出。现有的二代测序文库构建方法存在耗时、易于丢失大量样本和形成引物二聚体等缺点，从而导致对待测序遗传物质的低覆盖率。因此，需要更好的构建测序文库的方法。由其需要一种能够减少引物二聚体形成地、以多重PCR为基础的文库构建方法。提供本背景信息的目的是阐明申请人认为已知的信息与本专利技术可能有关，不必认为也不应解释为上述任何信息是依照本专利技术推衍的现有技术。
技术实现思路
本专利技术通过改进二代测序建库实验流程减少了超高重PCR引物二聚体形成。本专利技术的方法和成分降低了与NGS文库制备、DNA样本利用率相关的成本。在某些实施方案中，本专利技术提供了一种构建二代测序文库的方法，该方法包括：a)提供包含核酸的样本，该样本所含部分核酸中应具有靶核酸序列；b)富集步骤a)所述的靶核酸序列；c)针对靶核酸序列进行第一次多重PCR以获得扩增子；d)对步骤c)所得样品进行富集以获得目标扩增子；e)对所述目标扩增子、测序接头和barcode进行第二次多重PCR以获得带有barcode的目标扩增子，从而构建二代测序文库。在某些实施例中，本专利技术提供的构建二代测序文库的方法包括：a)提供包含核酸的样本，该样本所含部分核酸中应具有靶核酸序列；b)富集步骤a)所述的靶核酸序列；c)针对靶核酸序列进行第一次多重PCR以获得扩增子；d)对步骤c)所得样品进行富集以获得目标扩增子；e)对所述目标扩增子、测序接头和barcode进行第二次多重PCR以获得带有barcode的目标扩增子；f)富集步骤e)所述的带有barcode的目标扩增子，从而构建二代测序文库。在某些实施例中，靶核酸序列包括1～300个核苷酸。在某些实施例中，富集步骤包括使样本与磁珠接触，其中所述磁珠结合到样本中的靶核酸序列；以及从剩余样本中分离结合到所述磁珠的靶核酸序列。在某些实施例中，第一次或第二次多重PCR包括多个引物对和热启动聚合酶。在某些实施例中，引物对包括通用序列和目标序列。在某些实施例中，扩增子包括通用序列和目标序列。在某些实施例中，富集步骤包括将扩增子应用到过滤器上，其中过滤器保留大量扩增子，但允许未消耗引物和引物二聚体通过过滤器。在某些实施例中，过滤器是PCR产物过滤器。在某些实施例中，富集步骤包括将扩增子、引物二聚体和/或未消耗引物应用到过滤器上，以提供过滤纯化扩增子、引物二聚体和/或未消耗引物，并使所述过滤纯化扩增子、引物二聚体和/或未消耗引物与磁珠接触，其中所述磁珠结合到所述过滤纯化扩增子；以及从未结合到所述磁珠的引物二聚体和/或未消耗引物中分离结合到所述磁珠的过滤纯化扩增子。在某些实施例中，第二次多重PCR采用正向引物和下游引物。在特定实施例中，下游引物具有测序接头和通用序列。在某些实施例中，下游引物具有测序接头、barcode和通用序列。在某些实施例中，正向引物包括测序接头和通用序列。在某些实施例中，正向引物具有测序接头、barcode和通用序列。在某些实施例中，富集操作所采用的方法包括使用磁珠在含有带有barcode的目标扩增子、引物二聚体和/或未消化引物的样品中结合所述带有barcode的目标扩增子后自剩余物中分离。在某些实施例中，富集操作所采用的方法包括使用磁珠在核酸和靶核酸中结合所述核酸而使所述核酸与所述靶核酸分离。在某些实施例中，富集操作所采用的方法包括采用过滤器处理含有靶核酸、引物二聚体、dNTP和/或引物的样品，其中，过滤器仅截留靶核酸。在某些实施例中，过滤器为PCR产物过滤器。在某些实施例中，富集操作所采用的方法还包括对靶核酸进行凝胶电泳、醇沉或柱层析。在某些实施例中，多重PCR包括至少100个靶核酸序列、500个靶核酸序列或1,000个靶核酸序列。在某些实施例中，第一次或第二次多重PCR在低于40次PCR循环、30次PCR循环、20次PCR循环或15次PCR循环中进行。在某些实施例中，第一次多重PCR或第二次多重PCR中使用了磷酸钾。在某些实施例中，多重PCR中磷酸钾的浓度至少为5mM、10mM或15mM。在某些实施例中，多重PCR所采用的引物浓度至少为10nM、20nM或40nM。在某些实施例中，本专利技术的方法还包括测序以检测基因变异。在某些实施例中，基因变异为染色体非整倍性。在某些实施例中，染色体非整倍性是胎儿染色体非整倍性。在某些实施例中，靶核酸来自胎儿、儿童和/或成人。本专利技术还公开了所构建的测序文库用于测序的用途。在某些实施例中，测序采用第二代测序技术或第三代测序技术。在某些实施例中，测序包括基因组DNA测序、目标片段捕获测序、单链DNA片段测序、化石DNA测序和对生物样本游离DNA进行的测序。在某些实施例中，生物样本包括血液、血浆、尿液或唾液。本专利技术公开后，熟悉本领域的普通技术人员很容易理解本专利技术的相关实施例和某些实施例。参考引用本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请的全部内容将通过参考引用纳入本文，等同于每个单独出版物、专利或专利申请经具体和单独指示通过参考引用纳入本文。附图说明图1列出显示了文库PCR产物的大小和数量的数据。该图说明了使用本专利技术的过滤器和磁珠在多重PCR后去除未消耗引物和引物二聚体的过程。图2A-2B列出了表明多重PCR过度扩增会导致NGS文库定量不足的数据。图3显示了PCR进程中磷酸钾浓度对靶基因扩增的作用。图4显示了PCR引物浓度对靶基因碎片率的作用。图5显示了应用本专利技术对短片段靶基因进行的富集。图6显示了不同PCR聚合酶的引物-二聚体和目标DNA测序数据的读取长度直方图。图7A-7B显示了文库PCR产物的大小和数量。图7A显示了使用本专利技术磁珠制备的文库PCR产物的大小和数量。图7B显示了使用本专利技术过滤器和磁珠制备的文库PCR产物的大小和数量。具体实施方式本专利技术的每项技术特征均可包括多种实施例。因此，在对本专利技术进行理解时，应认为其所涉及的各项技术特征均包括任一要素或由要素组成的任一组合而构成的多种方式。本专利技术的应用不限于下述的具体结构和要素组成。本专利技术可具有某些实施例，并由多种方式实现或执行。此外，本说明书中使用的措辞和术语仅为描述性的，不应视为具有限制性。专利技术中“包含”、“包括”或“具有”、“具备”、“涉及”及其它类似用语是指包含其后所列项目、对等项目以及附加项目。除非上下文另有明确说明，否则如本文和所附权利要求中使用的名词均包含单数及复数含义。例如，“核酸”也暗指技术人员熟知的多种类似核酸或等同物等等。“大约”一词意味着正负百分之五的偏差，特别是与给定数量有关时。本专利技术中所使用的“细胞”是指从原核生物、真核生物或古核生物中分离的任何类型的细胞，包括细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：/na)提供包含核酸的样本，其中，所述样本中的一些所述核酸具有靶核酸序列；/nb)富集步骤a)所述的靶核酸序列；/nc)针对靶核酸序列进行第一次多重PCR以获得扩增子；/nd)对步骤c)所得样品进行富集以获得目标扩增子；/ne)对所述目标扩增子、测序接头和barcode进行第二次多重PCR以获得带有barcode的目标扩增子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)提供包含核酸的样本，其中，所述样本中的一些所述核酸具有靶核酸序列；
b)富集步骤a)所述的靶核酸序列；
c)针对靶核酸序列进行第一次多重PCR以获得扩增子；
d)对步骤c)所得样品进行富集以获得目标扩增子；
e)对所述目标扩增子、测序接头和barcode进行第二次多重PCR以获得带有barcode的目标扩增子。


2.一种用于构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)提供包含核酸的样本，其中，所述样本中的一些所述核酸具有靶核酸序列；
b)富集步骤a)所述的靶核酸序列；
c)针对靶核酸序列进行第一次多重PCR以获得扩增子；
d)对步骤c)所得样品进行富集以获得目标扩增子；
e)对所述目标扩增子、测序接头和barcode进行第二次多重PCR以获得带有barcode的目标扩增子；
f)富集步骤e)所述的带有barcode的目标扩增子。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶核酸序列包括1～300个核苷酸。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集操作所采用的方法包括使用磁珠，其中，所述磁珠在样品中结合靶核酸序列后，自剩余样品中分离。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一次多重PCR或第二次多重PCR采用一组以上的引物对以及一个热启动聚合酶。


6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物对具有通用序列和靶序列。


7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩增子具有通用序列和靶序列。


8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集操作所采用的方法包括使用过滤器处理扩增子，其中，所述过滤器截留扩增子而允许未消化引物和引物二聚体通过。


9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述过滤器为PCR产物过滤器。


10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述富集操作所采用的方法还包括采用过滤器处理含有扩增子、引物二聚体和/或未消化引物的样品，并采用磁珠结合过滤的扩增子后自剩余物中分离。


11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二次多重PCR采用正向引物和下游引物。


12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述下游引物具有测序接头和通用序列。


13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述下游引物具有测序接头、barcode和通用序列。


14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述正向引物包括测序接头和通用序列。


15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述正向引物具有测序接头、barcode和通用序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：杨亮，冯骏，张海川，
申请(专利权)人：赛雷纳中国医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51