【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用差异性标记的等位基因特异性探针分析混合样品的基于阵列的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2017年6月2日提交的美国临时专利申请第62/514,681号、于2017年6月2日提交的美国临时专利申请第62/514,714号以及于2017年6月2日提交的美国临时专利申请第62/514,629号的优先权，所述美国临时专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文中。
本公开提供了可用于基于阵列对混合核酸群体分析的方法和系统，所述方法和系统包含对混合核酸群体的各个亚群进行基因分型和拷贝数分析。本公开还提供了用于诊断从生物得到的混合核酸群体中遗传异常的方法和系统。例如，本文公开了可用于使用以非侵入性方式从怀孕女性或患者获得的样品来诊断胎儿遗传异常或肿瘤遗传异常的方法和系统。这些样品可以包括衍生自血液、血浆、血清、尿液、粪便或唾液的混合核酸群体。
技术介绍
对从单一组织来源(如血液、尿液或唾液)中获得的但含有不同的核酸亚群的混合核酸群体(例如DNA和RNA样品)的分析，已经引起了研究界和医疗界的极大兴趣。可以使用合适的方法来分析从怀孕女性得到的无细胞DNA(或RNA)衍生的混合核酸群体，以确定胎儿特征，包括疾病遗传。类似地，可以分析从癌症患者得到的无细胞DNA(或RNA)衍生的混合核酸群体，以确定各种特征，如肿瘤恶性度、肿瘤起源或药物敏感性。尽管对此类混合核酸群体的分析可能由于各种亚群之间的高度相似性而在技术方面变得很复杂，但是通过如放血或尿液/唾液收集等程序以低廉、快速且非侵入性的方式获得适当的混合核酸样...
【技术保护点】
1.一种用于分析从生物获得的混合核酸样品的方法，其包括：/n从生物获得或衍生含有混合核酸群体的核酸样品，所述混合核酸群体包含主要亚群和次要亚群，其中所述主要亚群和所述次要亚群各自包含位于第一核酸基因座中并且含有多态性位点的靶序列，其中所述多态性位点可以包含第一核苷酸变体和第二核苷酸变体的组合；/n对所述多态性位点进行基因分型，其中所述基因分型包括：/n(a)将含有或衍生自所述核酸群体并且含有所述多态性位点的至少一个核酸片段与寡核苷酸阵列的寡核苷酸探针杂交；以及/n(b)使用检测器从寡核苷酸阵列检测指示对应于第一等位基因变体的第一核苷酸变体存在或不存在的第一信号(“A信号”)和指示对应于第二等位基因变体的第二核苷酸变体存在或不存在的第二信号(“B信号”)。/n
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170602 US 62/514,629;20170602 US 62/514,681;20171.一种用于分析从生物获得的混合核酸样品的方法，其包括：
从生物获得或衍生含有混合核酸群体的核酸样品，所述混合核酸群体包含主要亚群和次要亚群，其中所述主要亚群和所述次要亚群各自包含位于第一核酸基因座中并且含有多态性位点的靶序列，其中所述多态性位点可以包含第一核苷酸变体和第二核苷酸变体的组合；
对所述多态性位点进行基因分型，其中所述基因分型包括：
(a)将含有或衍生自所述核酸群体并且含有所述多态性位点的至少一个核酸片段与寡核苷酸阵列的寡核苷酸探针杂交；以及
(b)使用检测器从寡核苷酸阵列检测指示对应于第一等位基因变体的第一核苷酸变体存在或不存在的第一信号(“A信号”)和指示对应于第二等位基因变体的第二核苷酸变体存在或不存在的第二信号(“B信号”)。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述第一信号和所述第二信号，确定所述次要亚群、所述主要亚群或所述主要亚群和所述次要亚群两者中所述第一核酸基因座的拷贝数。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述第一信号和所述第二信号，确定所述主要亚群、所述次要亚群或所述主要亚群和所述次要亚群两者中含有所述第一核酸基因座的染色体的拷贝数。
4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述第一信号和所述第二信号，确定所述次要亚群的所述多态性位点的基因型。
5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述第一信号和所述第二信号，确定所述主要亚群的所述多态性位点的基因型。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使用所述第一信号和所述第二信号，确定所述混合核酸群体中所述主要亚群和所述次要亚群的相对量。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述主要亚群和所述次要亚群源自所述生物中的不同来源。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合核酸群体包含无细胞DNA。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述无细胞DNA从所述生物的血液、血浆、血清、尿液、粪便或唾液获得或衍生。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物包含肿瘤，所述主要亚群包含或衍生自正常组织或并且所述次要亚群包含或衍生自所述肿瘤。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物是怀孕女性，所述混合核酸群体是从所述怀孕女性的血液获得的无细胞DNA，所述主要亚群包含或衍生自母体核酸，并且所述次要亚群包含或衍生自胎儿核酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述次要亚群包含胎儿DNA，所述胎儿DNA按不大于所述核酸样品中总DNA的20％存在。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA不大于所述核酸样品中总DNA的15％。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA不大于所述核酸样品中总DNA的10％。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA不大于所述核酸样品中总DNA的5％。
16.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA不大于所述核酸样品中总无细胞DNA的15％并且不小于其1％。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA为所述核酸样品中总DNA的约30％。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA不大于所述核酸样品中总DNA的30％。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述胎儿DNA超过所述核酸样品中总DNA的30％。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合核酸群体含有或衍生自无细胞DNA，所述无细胞DNA在所述生物的血液中以不大于5ng/mL并且不小于0.1ng/mL的浓度存在。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所使用的混合核酸群体的量不大于50ng、40ng、30ng、15ng、10ng、5ng、3ng或1ng。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述多态性位点包含双等位基因SNP，所述第一核苷酸变体是所述SNP的第一等位基因变体(“A等位基因”)并且所述第二核苷酸变体是所述SNP的第二等位基因变体(“B等位基因”)。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测器包含第一检测通道和第二检测通道，并且所述方法进一步包括检测所述第一检测通道中所述第一信号和所述第二检测通道中所述第二信号的步骤。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述SNP可以包含所述A等位基因或所述B等位基因，并且其中SNP基因型可以对所述A等位基因是纯合的(“AA”)、对所述B等位基因是纯合的(“BB”)或是杂合的(“AB”)。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括使所述核酸样品与线性分子倒置探针汇集物接触以提供复性混合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包含至少1,000个线性分子倒置探针。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括至少5,000个线性分子倒置探针。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括至少10,000个线性分子倒置探针。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括至少20,000个线性分子倒置探针。
30.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括少于200,000个线性分子倒置探针。
31.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括少于100,000个线性分子倒置探针。
32.根据权利要求25所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物包括少于80,000个线性分子倒置探针。
33.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物的至少50％结合来自染色体1、5、13、18、21、X和Y的DNA片段。
34.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物的至少60％结合来自染色体1、5、13、18、21、X和Y的DNA片段。
35.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中所述线性分子倒置探针汇集物的至少70％结合来自染色体1、5、13、18、21、X和Y的DNA片段。
36.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中线性分子倒置探针的总数与DNA片段拷贝的总数的比率为约40,000:1。
37.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中线性分子倒置探针的总数与DNA片段拷贝的总数的比率为至少15,000:1。
38.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中线性分子倒置探针的总数与DNA片段拷贝的总数的比率为至少30,000:1。
39.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中线性分子倒置探针的总数与DNA片段拷贝的总数的比率小于100,000:1。
40.根据权利要求25到32中任一项所述的方法，其中线性分子倒置探针的总数与DNA片段拷贝的总数的比率小于60,000:1。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括将所述复性混合物分成第一通道组合物和第二通道组合物。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述第一通道组合物包含dATP和dTTP的混合物。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述第一通道组合物基本上不含dGTP或dCTP。
44.根据权利要求41到43中任一项所述的方法，其中所述第二通道组合物包含dGTP和dCTP的混合物。
45.根据权利要求41到44中任一项所述的方法，其中所述第二通道组合物基本上不含dATP或dTTP。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括将脱氧核苷酸混合物添加到所述第一通道组合物和所述第二通道组合物中的每一者，其中添加到所述第一通道组合物的所述脱氧核苷酸混合物与添加到所述第二通道组合物的所述脱氧核苷酸混合物不同。
47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括使所述第一通道组合物和所述第二通道组合物与连接酶接触以形成第一环化探针组合物和第二环化探针组合物。
48.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括切割所述第一环化探针组合物和所述第二探针组合物以形成含有或衍生自所述核酸群体的核酸片段。
49.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括扩增含有或衍生自所述核酸群体的第一核酸片段和第二核酸片段。
50.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述扩增步骤在聚合酶存在的情况下实施。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述聚合酶是包含所述聚合酶和聚合酶抑制剂的热启动聚合酶。
52.根据权利要求51所述的方法，其中当温度为至少40℃时，所述聚合酶抑制剂与所述聚合酶解离。
53.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述基因分型步骤进一步包括组合含有或衍生自所述核酸群体的所述第一核酸片段和所述第二核酸片段。
54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述检测步骤进一步包括用结合到所述第一等位基因变体的第一试剂和结合到所述第二等位基因变体的第二试剂标记含有或衍生自所述核酸群体的表面结合的第一核酸片段和第二核酸片段。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述第一试剂包含抗体。
56.根据权利要求54或55所述的方法，其中所述第一试剂包含与第一靶序列的一部分互补的序列。
57.根据权利要求54到56中任一项所述的方法，其中所述第一试剂进一步包含与所述互补序列缀合的识别元件。
58.根据权利要求54所述的方法，其中所述识别元件是生物素。
59.根据权利要求54到58中任一项所述的方法，其中所述第一试剂进一步包含荧光标记的抗生物素蛋白。
60.根据权利要求54到59中任一项所述的方法，其中所述第一试剂进一步包含结合抗生物素蛋白的抗体。
61.根据权利要求60所述的方法，其中结合抗生物素蛋白的所述抗体用生物素标记。
62.根据权利要求54到61中任一项所述的方法，其中所述第一试剂进一步包含结合所述识别元件的抗体。
63.根据权利要求62所述的方法，其中结合所述识别元件的所述抗体用报道分子标记。
64.根据权利要求54到63中任一项所述的方法，其中所述第一试剂包含荧光团。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述第一试剂的所述荧光团具有介于约640nm与约680nm之间的荧光发射峰。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述第一试剂的所述荧光团为别藻蓝蛋白。
67.根据权利要求54所述的方法，其中所述第二试剂包含与第二靶序列的一部分互补的序列。
68.根据权利要求67所述的方法，其中所述第二试剂进一步包含与所述互补序列缀合的识别元件。
69.根据权利要求68所述的方法，其中所述识别元件是FAM。
70.根据权利要求67到69中任一项所述的方法，其中所述第二试剂进一步包含结合所述识别元件的第一抗体。
71.根据权利要求67到69中任一项所述的方法，其中所述第二试剂进一步包含结合所述第一抗体的第二抗体。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述第一抗体、所述第二抗体或所述第一抗体和所述第二抗体两者均用荧光团标记。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述第二试剂的所述荧光团具有介于约560nm与约600nm之间的荧光发射峰。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述第二试剂的所述荧光团为别藻蓝蛋白。
75.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述无细胞DNA组合物的所述步骤在小于50μL的反应体积中进行。
76.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述无细胞DNA组合物的所述步骤在小于40μL的反应体积中进行。
77.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中接触所述无细胞DNA组合物的所述步骤在小于30μL的反应体积中进行...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·萨珀斯基，M·沙培罗，J·施密特，E·冯，O·米茲莱曼，李江，M·查达，A·舒克拉，
申请(专利权)人：昂飞股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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