通过管内杂交与通用标签-微阵列的组合的突变的基因分型制造技术

目标基因片段的测定方法，其包括：扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物；从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；在溶液中将所述单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；检测微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。在与癌症基因分型相关的优选实施方案中，KRAS癌基因的出人意料的良好结果表明所研究的所有7种密码子12和13突变可在小于90分钟内在组织临床样品中明确检测到。此外，该系统可以揭示代表少于0.1％起始材料的突变等位基因。通过将突变检测与阵列杂交解偶联，该技术变得通用。

Genotyping of mutations by in tube hybridization and universal tag microarray combinations

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过管内杂交与通用标签-微阵列的组合的突变的基因分型背景鉴定可导致疾病的DNA变体是人类遗传学的核心目标。具体而言，检测与恶性疾病相关的突变的能力有助于早期诊断、预防和治疗1,2。癌症活检样品中的低频单核苷酸突变检测具有挑战性，因为它需要区分两个高度相似的序列，其中之一（野生型序列）显著地比另一个更丰富3。液体活检是用于描述一类新兴的血液测试的术语，所述血液测试意在替代组织活检，以获得有关癌症的诊断、预后和治疗诊断信息。液体活检可以让医生获得患者特异性癌症的系统观点以及随时间监测它们的能力。使用血液、尿液、唾液，脑脊液、胸腔积液而不是组织，可以通过分析循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测致癌的基因组改变。检测液体活检样品中的低频单核苷酸突变甚至比组织活检中更具挑战性，因为ctDNA占血液中总循环游离DNA的不到1％。因此，标准测序技术，诸如Sanger测序或焦磷酸测序，只能在肿瘤负荷较重的患者中检测ctDNA。数字聚合酶链反应的引入已使得能够以相当一致的方式检测ctDNA。具体而言，液滴数字PCR（ddPCR）是新开发的方法之一，其允许在DNA（野生型和突变体DNA）的复杂混合物中计数稀有突变体变体。基于水-乳液液滴技术，ddPCR将DNA样品分级为例如20,000个液滴。随后在每个单独的液滴中发生模板的突变特异性扩增，并且计数阳性液滴给出精确的、绝对靶定量，作为每毫升血浆的拷贝数。据报道，ddPCR可以高灵敏度（0.01-0.001％）检测突变等位基因。但是，该方法缺乏多路复用能力。另一种复杂且昂贵的基于ctDNA的癌症测试是靶向扩增子测序。最近，已经提出该技术有利于从基础研究到临床实践的转化。实际上，在特定条件下的下一代测序（NGS）可以达到分析ctDNA所需的高灵敏度，但是它昂贵且耗时。此外，它允许仅并行处理有限数量的样品并要求血浆样品特异性的生物信息学技能或已经开发的生物信息学工具。近年来，已经进行了许多额外的努力来开发用于检测低丰度突变的其他高度特异性和敏感性技术，包括实时PCR、在较低变性温度下的共扩增-PCR（COLD-PCR）、焦磷酸测序、数字PCR3,4和NGS。这些方法中的每一种都有优点和缺点。在这种情况下，本工作中提出的基于微阵列的方法代表了用于高通量检测单核苷酸突变的通用工具5-7。在消化器官和肺癌中，经常检测到KRAS癌基因的各种活化点突变。在肿瘤发生中，它们被认为改变GTP酶活性，导致不受调节的细胞增殖和恶性转化8-10。最常见的突变聚集在位于外显子2中密码子12和1311的非常狭窄的区域中。这些位点被认为是致癌过程中的突变热点。尽管突变的KRAS是目前唯一具有美国FDA批准的转移性结肠直肠癌（mCRC）伴随诊断测试的生物标志物12，但许多新兴的生物标志物（NRAS、BRAF和PIK3CA）可能证实为在临床上有用。各种方法已用于鉴定KRAS基因突变，诸如直接DNA测序13、下一代测序14、突变体富集聚合酶链反应（PCR）15、基于肽核酸（PNA）的PCR16、限制性内切核酸酶介导的选择性(REMS)-PCR17、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）18、突变管测定（MUTA）测试19、等位基因特异性竞争性阻断剂PCR（ABC-PCR）20。然而，这些方法耗时且成本高昂，需要费力的程序操作。DNA微阵列已在基因分型应用中使用多年，包括SNP分型（SNP是“单核苷酸多态性”）。例如，Affymetrix和Illumina将SNP阵列平台商业化用于数百万个SNP的基因分型7，但是，它们主要应用于研究活动。据我们所知，通过微阵列技术进行KRAS基因分型的实例仅有几个。它们包括PamChip微阵列21，Liu等人报道的寡核苷酸标签化的微阵列22和“邮编阵列(zip-codearray)”与聚合酶链反应/连接酶检测反应（PCR/LDR）的组合23,24。这些测定在检测KRAS密码子12突变中的灵敏度低，在PCR/LDR的情况下范围为25-10％至最小1％。为了提高灵敏度，在先前的工作中25，基于“扩增子降低”方法在层状硅/氧化硅基底上开发了用于微阵列的测定，所述微阵列涂覆有二甲基丙烯酰胺（DMA）、N-丙烯酰基氧基琥珀酰亚胺（NAS）和间丙烯酰基丙基三甲氧基硅烷（MAPS）的共聚物，即共聚（DMA-NAS-MAPS）26,27。该聚合物在载片表面上形成三维功能涂层，其能够以高密度结合氨基修饰的寡核苷酸。证明该测定形式在分配KRAS突变的正确基因分型方面是高度特异性的。尽管有阳性结果，但该方法存在一个主要缺点，因为它需要通过大多数临床实验室无法获得的商用点样仪来点样(spotting)PCR产物。为了克服这个问题，引入了固相PCR测定，其中扩增子在载片表面上原位产生28。该方法避免了沉积PCR片段的需要，但缺乏能够在野生型DNA背景中检测到仅以1％存在的突变等位基因的所需灵敏度。显然，需要更好、更准确、更灵敏和/或更快速的测定方法和/或组合物来实现这些和其他目标。概述本文描述和/或要求保护方法、组合物、系统和/或试剂盒的多个方面和实施方案。方法包括制备方法和使用方法。为了克服过去方法诸如例如ddPCR和靶向扩增子测序的限制，在优选实施方案中，公开了基于单链标签化的PCR产物和特异性双结构域寡核苷酸报道物之间的管内特异性杂交与特定微阵列位置（2D阵列）处的表面捕获的组合的新方法。例如，第一方面是目标基因片段的测定方法，其包括：扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物；从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；在溶液中将单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；检测微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。在一个实施方案中，待扩增的片段在扩增中引发，以使得能够在测定的后续步骤中检测分离的单链。在另一个实施方案中，待扩增的片段在扩增中引发以使得能够（1）在测定的后续步骤中将初始扩增产物的一条单链与另一条单链分离，和（2）在测定的后续步骤中检测分离的单链。在另一个实施方案中，从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物（其中单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域）包括分离单链扩增产物。在另一个实例中，第二方面提供了目标基因片段的测定方法，其包括：扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物，其中待扩增的片段在扩增中引发以使得能够（1）在测定的后续步骤中将初始扩增产物的一条单链与另一条单链分离，和（2）在测定的后续步骤中检测分离的单链；从初始扩增产物中分离至少一种单链本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.目标基因片段的测定方法，其包括：/n扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物；/n从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；/n在溶液中将所述单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；/n将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；/n检测所述微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170331 US 62/4799951.目标基因片段的测定方法，其包括：
扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物；
从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；
在溶液中将所述单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
检测所述微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。


2.目标基因片段的测定方法，其包括：
扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标基因片段，以形成初始扩增产物，其中待扩增的片段在扩增中引发以使得能够（1）在测定的后续步骤中将初始扩增产物的一条单链与另一条单链分离，和（2）在测定的后续步骤中检测分离的单链；
从初始扩增产物中分离至少一种单链扩增产物，其中单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域；
在溶液中将单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，其中所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
检测所述微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。


3.目标KRAS、NRAS、BRAF和/或PIK3CA癌基因片段的测定方法，其包括：
扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标KRAS、NRAS、BRAF和/或PIK3CA癌基因片段，以形成初始扩增产物；
使用变性和偶联至珠粒，从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域，其中任选地，将分离的单链扩增产物在进一步杂交前稳定；
在溶液中将所述单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，并且其中杂交步骤包括施加覆盖至少两种不同杂交温度的温度梯度，并且其中所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
用荧光检测所述微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。


4.目标KRAS、NRAS、BRAF和/或PIK3CA癌基因片段的测定方法，其包括：
扩增至少一种包含或可能包含至少一种目标SNP区域的目标KRAS、NRAS、BRAF和/或PIK3CA癌基因片段，以形成初始扩增产物，其中待扩增的片段在扩增中引发以使得能够（1）在测定的后续步骤中通过与珠粒偶联，将初始扩增产物的一条单链与另一条单链分离，和（2）在测定的后续步骤中通过荧光检测检测分离的单链；
使用变性和偶联至珠粒从初始扩增产物中分离至少一种单链扩增产物，其中单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域，其中任选地，将分离的单链扩增产物在进一步杂交前稳定；
在溶液中将单链扩增产物与至少一种报道分子杂交，所述报道分子包含寡核苷酸的至少两个不同的结构域，其中寡核苷酸的第一结构域用于与单链扩增产物杂交，并且其中寡核苷酸的第二结构域用于与至少一种微阵列探针表面杂交，并且其中杂交步骤包括施加覆盖至少两种不同杂交温度的温度梯度，并且其中所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
将杂交单链扩增产物的溶液与至少一种微阵列探针表面接触，所述微阵列探针表面包含至少一种捕获探针以允许杂交；
用荧光检测所述微阵列表面上杂交单链扩增产物的存在。


5.权利要求1或3所述的测定，其中待扩增的片段在扩增中引发以使得能够在测定的后续步骤中检测分离的单链。


6.权利要求1或3所述的测定，其中待扩增的片段在扩增中引发以使得能够（1）在测定的后续步骤中将初始扩增产物的一条单链与另一条单链分离，和（2）在测定的后续步骤中检测分离的单链。


7.权利要求1或3所述的测定，其中从初始扩增产物形成至少一种单链扩增产物包括分离单链扩增产物，其中所述单链扩增产物包含或可能包含至少一种目标SNP区域。


8.权利要求1-2中任一项所述的测定，其中所述测定和目标基因片段用于检测KRAS、NRAS、BRAF和/或PIK3CA癌基因中的至少一种单突变。


9.权利要求1-8中任一项所述的测定，其中所述测定和目标基因片段用于检测KRAS癌基因中的至少一种单突变。


10.权利要求1-9中任一项所述的测定，其中所述测定和目标基因片段用于检测密码子12、和/或密码子13、和/或密码子61、和/或密码子146处的至少一种KRAS癌基因突变。


11.权利要求1-10中任一项所述的测定，其中所述测定和目标基因片段用于检测密码子12和/或密...

【专利技术属性】
技术研发人员：玛赛拉·基亚里，弗朗西斯科·达明，西尔维亚·加尔比亚蒂，莫里齐奥·费拉里，
申请(专利权)人：玛赛拉·基亚里，弗朗西斯科·达明，西尔维亚·加尔比亚蒂，莫里齐奥·费拉里，
类型：发明
国别省市：意大利;IT