酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，其中，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法包括以下步骤：提取具有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。目的在于提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，酪氨酸解氨酶的转化效率高，稳定性好。

Tyrosinase recombinants, tyrosinase and their preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用。
技术介绍
TAL(Tyrosineammonialyase，酪氨酸解氨酶)是一种重要的苯丙素类化合物前体转化关键酶，能够高效地将酪氨酸转化为肉桂酸，实现进一步的产物应用。植物中发现TAL存在于高粱、大麦、小麦、燕麦、水稻、玉米、甜甘蔗、欧芹等单子叶植物中。微生物中则已发现担子菌、荚膜红细菌、放线菌、粘红酵母及丝孢酵母。由于自然界中肉桂酸含量的限制，导致生物转化苯丙烷代谢受限，并进一步限制了苯丙素类活性化合物的应用开发工作。因此，需要开发一种促进苯丙烷代谢的酶，进而提高产物的产量。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种酪氨酸解氨酶重组菌、酪氨酸解氨酶及其制备方法和应用，酪氨酸解氨酶的转化效率高，稳定性好。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：本专利技术提供一种酪氨酸解氨酶重组菌，所述酪氨酸解氨酶重组菌中具有如SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的重组质粒。在一个具体实施例中，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法包括以下步骤：提取具有如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。在一个具体实施例中，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。本专利技术还提供一种酪氨酸解氨酶的制备方法，对上述任一实施例所述的酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体；将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液；将所述上清液进行分离纯化，获得酪氨酸解氨酶。在一个具体实施例中，对酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体，包括以下步骤：在含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在100～500rpm、25～45℃条件下，扩大培养至OD600达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时，获得菌体。本专利技术还提供一种通过上述任一实施例所述的酪氨酸解氨酶的制备方法制备的酪氨酸解氨酶。本专利技术还提供一种酪氨酸解氨酶在苯丙素类化合物前体转化中的应用。在一个具体实施例中，将0.01～0.05摩尔体积的第一酪氨酸解氨酶和/或第二酪氨酸解氨酶加入pH为7.0～12.0的磷酸盐缓冲溶液中，并加入40～60摩尔体积的甘氨酸碱性缓冲液、10～20摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀在30℃～70℃下培育不少于1小时，再在沸水浴中处理8～15min，再进行离心处理，获取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。本专利技术还提供一种酪氨酸解氨酶重组菌在苯丙素类化合物前体转化中的应用。在一个具体实施例中，将所述第一酪氨酸解氨酶重组菌和/或所述第二酪氨酸解氨酶重组菌采用含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，100～500rpm，25～45℃，培养至OD600达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时后进行分离、清洗，收集重组菌体，将所述重组菌体转入pH为7～12的磷酸盐缓冲溶液中，并加入0.01～0.05摩尔体积的酪氨酸或苯丙氨酸，混合均匀，在100～500rpm、28～37℃条件下反应4～8小时；再向反应液中加入100～300摩尔体积的盐酸后，进行离心，取上清液，获得3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸或3-苯基-2-丙烯酸。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：本专利技术先提取SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的目标基因，通过PCR扩增并连接到质粒获得重组质粒，将重组质粒导入大肠杆菌获得酪氨酸解氨酶重组菌。将获得的酪氨酸解氨酶重组菌经过扩大培养、分离、纯化后获得酪氨酸解氨酶。另外，酪氨酸解氨酶重组菌和酪氨酸解氨酶均可对苯丙素类化合物具有高效催化作用，且生产易操作、稳定性好，适于大规模工业化生产。附图说明图1为本专利技术酪氨酸解氨酶和重组质粒的电泳图；图2为本专利技术酪氨酸解氨酶的pH适应曲线；图3为本专利技术酪氨酸解氨酶的温度适应曲线；图4为本专利技术酪氨酸转化为3-(4-羟基苯基)-2-丙烯酸产物液相检测；图5为本专利技术苯丙氨酸转化为3-苯基-2-丙烯酸产物液相检测。具体实施方式以下将结合附图，对本专利技术进行更为详细的描述，需要说明的是，以下参照附图对本专利技术进行的描述仅是示意性的，而非限制性的。各个不同实施例之间可以进行相互组合，以构成未在以下描述中示出的其他实施例。本专利技术还提供一种重组质粒，该重组质粒包含有如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示序列的一种或两种酪氨酸解氨酶表达基因。本专利技术提供一种酪氨酸解氨酶重组菌，该酪氨酸解氨酶重组菌中具有如如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示核苷酸序列的重组质粒，也就是说，该酪氨酸重组菌包含有上述一种或两种重组表达质粒，用于表达上述一种或两种酪氨酸解氨酶。具体地，TAL(Tyrosineammonialyase，酪氨酸解氨酶)是一种重要的苯丙素类化合物前体转化关键酶，能够高效地将酪氨酸转化为肉桂酸，实现进一步的产物应用。本专利技术通过对已知TAL来源菌种的基因进行分析查找近似基因组，在基因库中筛选近似基因序列并进行确认，对确认具备相应基因序列的菌种序列进行克隆复制、扩大培养。实验研究发现糖丝菌属Saccharothrixsp.NRRLB-16348和链霉菌属Streptomycessp.NRRLF-4489全基因组中潜在有TAL近似功能的基因序列，通过设计引物序列，将疑似序列进行克隆扩增和表达(工程菌)，用底物进行测试，确定其确实具有相应底物转化功能(酪氨酸和苯丙氨酸转化)，同时效率较好。本专利技术提供一种酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，包括以下步骤：提取具有如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的目标基因；将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。其中，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。具体地，酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，包括以下步骤：(1)提取基因：使用Quick-DNA全序列提取试剂盒(ZymoResearch,USA)从所述糖丝菌属菌株中进行全基因序列提取，并获得第一目标基因Sas-TAL，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；或使用Quick-DNA全序列提取试剂盒(ZymoResearch,USA)从所述链霉菌属菌株中进行全基因序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种酪氨酸解氨酶重组菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶重组菌中具有如SEQ IDNO.1和/或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的重组质粒。/n

【技术特征摘要】
1.一种酪氨酸解氨酶重组菌，其特征在于，所述酪氨酸解氨酶重组菌中具有如SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的重组质粒。


2.一种如权利要求1所述的酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取具有如SEQIDNO.1或SEQIDNO.2所示的核苷酸序列的目标基因；
将目标基因连接至质粒，获得重组质粒；
将重组质粒导入菌体，获得酪氨酸解氨酶重组菌。


3.如权利要求2所述的酪氨酸解氨酶重组菌的构建方法，其特征在于，将目标基因连接至质粒，获得重组质粒，包括以下步骤：
对目标基因进行扩增后连接到第一质粒，获得重组载体；
对重组载体进行酶切处理，得到目标基因片段；
将目标基因片段连接到第二质粒，获得重组质粒。


4.一种酪氨酸解氨酶的制备方法，其特征在于，对权利要求1所述的酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体；将所述菌体破碎后进行离心分离，收集上清液；将所述上清液进行分离纯化，获得酪氨酸解氨酶。


5.如权利要求4所述的酪氨酸解氨酶的制备方法，其特征在于，对酪氨酸解氨酶重组菌进行培养，获得菌体，包括以下步骤：在含有5～70μg/mL卡那霉素的LB培养基中，在100～500rpm、25～45℃条件下，扩大培养至OD600达到0.4～0.6时，并向培养基中添加80～320μM异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，持续培养8～16小时，获得菌体。


6.一种如权利要求4或5所述的酪氨酸解氨酶的制备方...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶福平，秦勇，张炜，占纪勋，
申请(专利权)人：杭州唯铂莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33