一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用制造技术

本发明专利技术属于酒糟降解技术领域，具体为一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用。该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019856。该菌株用于酒糟纤维素的降解。该工程菌的重组内切葡聚糖酶对底物耐酸性强，转化效率高，可提高底物利用率，节约工艺成本。该方法构建的工程菌，缩短了菌株生长周期，可使内切葡聚糖酶的表达量及酶活性大大提高，其较强的耐酸性质，适用于酒糟这种酸性环境，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。

An efficient acid resistant endoglucanase engineering strain based on distiller's grains and its application

【技术实现步骤摘要】
一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用
本专利技术属于酒糟降解
，具体为一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用。
技术介绍
酒糟以其独特的固态发酵方式和固态白酒蒸馏生产而出现，而我国酒糟年产量达数千万吨。酒糟中含有粗蛋白质、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维(包括木质素、纤维素和半纤维素)、灰分和无氮提取物，除此之外，酒糟中还含有多种酶、有机酸和大量菌体自溶产生的嘌呤、嘧啶和类脂化合物。研究表明，利用酒糟生产生物有机肥，以其独特的优势，可以为农业废弃物和农作物生产搭建一座桥梁，开辟以“酒糟－生物有机肥－农作物”为循环模式的可持续发展道路。然而，传统腐熟剂中的菌株存在生长周期长，酶活性低等问题，影响酒糟腐熟。由于酒糟酸度高，酒糟粗纤维难以降解，造成酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，导致酒糟利用率低。这不仅是对资源的极大浪费，更会严重污染环境，无法实现对资源的可持续无污染利用。国内外学者围绕这一重大课题开展了大量的研究发现，利用微生物产生的纤维素酶可将酒糟降解为可利用的资源，提高酒糟的利用率，实现资源的可持续和无污染利用，也使酒糟具有一定的商业推广价值。纤维素酶是天然降解纤维素的一系列糖苷水解酶的总称，是降解过程中起协同作用的多组分酶。酒糟属于特殊的酸性环境，耐酸性差也是当前工程菌在酒糟降解和应用方面的瓶颈，因此有必要构建一株热稳定性高且耐酸性好的工程菌应用于酒糟降解腐熟方面，解决酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，提高酒糟利用率。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题，提出一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌。该菌株是利用酒糟这种特殊环境中的内源微生物构建的工程菌，在保留该菌特性的同时，达到提高内切葡聚糖酶酶活及表达量的目的。该菌通过单因素实验和响应面优化后，再次提高工程菌的酶活及表达量。经过Ni－NTA琼脂糖树脂纯化后得到重组内切葡聚糖酶纯酶，该酶在其最适温度45℃的条件下，可保持最高酶活的83％以上；在其最适pH4.5条件下，可保持最高酶活的89％以上。本专利技术的基因工程菌对底物的转化效率高，适用于酒糟这种酸性环境的底物，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。为了实现上述目的，本专利技术的具体技术方案为：一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019856，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，命名为EscherichiacoliBL21－P7。该菌株用于酒糟纤维素的降解，纤维素的降解率为34.22％。以上所述基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的应用，其包括以下步骤：1)称取一定量白酒生产企业的废弃物酒糟，并向酒糟中添加花生壳，搅拌均匀；酒糟与花生壳的质量比为0.5－1.5：2－4。作为优选，酒糟与花生壳的质量比为1：3。2)制备大肠杆菌BL21－P7上清液，并将该上清液与步骤1)中的酒糟与花生壳混合物搅拌均匀。作为优选，大肠杆菌BL21－P7上清液的添加量为花生壳与酒糟总质量的4％。3)向步骤2)的混合物中喷洒水、尿素和酒糟灰后进行发酵即实现对酒糟中纤维的降解。发酵时间视季节定，夏季发酵时间为10－15天，冬季发酵时间为25－30d；其余季节15－25d。作为优选，尿素的添加量为花生壳与酒糟总质量的0.3％；酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为5.0－8.0，水的添加量为使混合物的含水量为45wt％。大肠杆菌BL21－P7上清液的制备步骤为：按2％接种量将大肠杆菌BL21－P7种子液接种至500mlLB液体培养基(含氨苄终浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h。在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于6mlPBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后(冰浴环境)，8000rpm/min，10℃离心30min，吸取上清液。一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其命名为EscherichiacoliBL21－P7，该菌株的16SrDNA序列如下：上述16SrDNA序列全长1500个核苷酸。以上所述基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的实现方法，包括以下步骤：将酒糟中筛选出的内源野生枯草芽孢杆菌P7中编码内切葡聚糖酶的基因克隆出来，通过载体pET－32a(+)构建重组质粒pET－32a－P7，导入大肠杆菌BL21感受态细胞中构建工程菌BL21－P7。一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：通过将酒糟中筛选出的内源野生枯草芽孢杆菌P7中编码内切葡聚糖酶的基因克隆出来，通过载体pET－32a(+)构建重组质粒pET－32a－P7，导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中构建工程菌BL21－P7。利用酒糟这种特殊环境中的内源微生物构建工程菌，在保留该菌特性的同时，达到提高内切葡聚糖酶酶活及表达量的目的。该菌通过单因素实验和响应面优化后，再次提高工程菌的酶活及表达量。经过Ni－NTA琼脂糖树脂纯化后得到重组内切葡聚糖酶纯酶，该酶在其最适温度45℃的条件下，可保持最高酶活的83％以上；在其最适pH4.5条件下，可保持最高酶活的89％以上。以上所述工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：重组质粒的构建1、设计引物。采用PrimerPremier5引物设计软件，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)上已登录的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，HM036060.1))的内切葡聚糖酶基因序列设计上游引物(5’－GCGAATTCATGAAACGGTCAATTTCTATTTT－3’)和下游引物(5’－GCAAGCTTCTAATTGGGTTCTGTTCCCCAAA－3’)；其中，上游引物添加酶切位点EcoRⅠ，下游引物添加酶切位点HindⅢ。2、提取野生枯草芽孢杆菌P7基因组(所用试剂均来自细菌基因组DNA快速提取试剂盒)1)取1mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。2)加入200μl缓冲液RB重悬，10000rpm，离心30s，弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μl缓冲液RB中。3)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。4)平衡液预处理：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。5)冷却后加入100μl异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。6)将上一步混本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其特征在于：该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019856。/n

【技术特征摘要】
1.一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其特征在于：该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2019856。


2.如权利要求1所述工程菌的应用，其特征在于：该菌株用于酒糟纤维素的降解。


3.如权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)称取一定量白酒生产企业的废弃物酒糟，并向酒糟中添加花生壳，搅拌均匀；
2)制备大肠杆菌BL21－P7上清液，并将该上清液与步骤1)中的酒糟与花生壳混合物搅拌均匀；
3)向步骤2)的混合物中喷洒水、尿素和酒糟灰后进行发酵即实现对酒糟中纤维的降解。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤1)中酒糟与花生壳的质量比为0.5－1.5：2－4；大肠杆菌BL21－P7上清液的添加量为花生壳与酒糟总质量的3％－4％。


5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：尿素的添加量为花生壳与酒糟总质量的0.3％；酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为5.0－8.0，水的添加量为使混合物的含水量为45wt％。


6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：大肠杆菌BL21－P7上清液的制备步骤为：按2％接种量将大肠杆菌BL21－P7的种子液接种至500mlLB液体培养基，在37℃，180r/min的条件下培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h；在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于6mlPBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后，在8000rpm/min，10℃的条件下离心30min，吸取上清液。

【专利技术属性】
技术研发人员：左勇，秦世蓉，何颂捷，张晶，黄雪芹，
申请(专利权)人：四川轻化工大学，四川师范大学，
类型：发明
国别省市：四川;51