产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法技术

产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，包括：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；PCR扩增获得NADPH‑细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段并将其融合成为DNA片段SE‑CPR‑LS，将所述SE‑CPR‑LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c‑SE‑CPR‑LS；将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCduet‑1上，构建表达载体pACYCduet‑SS；将所述载体pet21c‑SE‑CPR‑LS和pACYCduet‑SS转化进入大肠杆菌感受态细胞，得产羊毛甾醇大肠杆菌菌株。本发明专利技术通过外源质粒导入方法改造大肠杆菌BL21(DE3)系统，使其能够合成羊毛甾醇，并通过密码子优化技术提高了外源基因在大肠杆菌系统中的表达量。

Construction method of E.coli Strain Producing lanosterol

【技术实现步骤摘要】
产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法。
技术介绍
羊毛甾醇别名异胆固醇，分子式为C30H50O。溶于乙醇、乙醚和氯仿；而在甲醇、丙酮中结晶。羊毛甾醇为无色粉末，具有很多重要的生物活性和广泛的药理作用，如降血压、降血糖、抗癌、治疗白内障等。而且羊毛甾醇还是多种重要的甾醇类物质生物合成的中间体，是化工、医药、食品行业的重要原料。合成生物学的发展为利用快速生长的微生物来异源表达生物合成基因，提供了一种潜在的生产途径。采用大肠杆菌表达系统具有很多优势，如：遗传操作简单、生长速度快，能在廉价培养基中高密度培养等。具报道(图1)，法尼基焦磷酸(FPP)通过鲨烯合成酶(squalenesynthase，SS)催化合成鲨烯(squalene)；而鲨烯通过鲨烯环氧酶(squaleneepoxidase,SE)在NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochromeP450reductase,CPR)的辅助作用下可以转化为2,3环氧角鲨烯(2,3-oxidosqualene本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如SEQ ID NO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；/nS2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；/nS3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-L...

【技术特征摘要】
1.产羊毛甾醇大肠杆菌菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：根据大肠杆菌密码子优化荚膜甲氧球菌的鲨烯环氧酶的密码子，优化后的序列如SEQIDNO.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列，以优化合成的载体为模板，PCR扩增获得鲨烯环氧酶基因片段；
S2：以提取的酿酒酵母w303基因组为模板，PCR扩增获得NADPH-细胞色素P450还原酶、鲨烯合成酶和羊毛甾醇合成酶基因片段；
S3：通过融合PCR的方法将鲨烯环氧酶、NADPH-细胞色素P450还原酶和羊毛甾醇合成酶基因片段融合成为DNA片段SE-CPR-LS，并将所述SE-CPR-LS片段通过酶切连接的方法克隆到载体pet21c上，构建表达载体pet21c-SE-CPR-LS；
S4：通过PCR扩增的方法将鲨烯合成酶基因片段扩增出来，并将所述鲨烯合成酶基因片段通过同源重组的方法克隆到载体pACYCdu...

【专利技术属性】
技术研发人员：宛雯，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32