靶向FLT3的嵌合抗原受体制造技术

本文提供特异性结合于Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的抗体；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)；以及表达此类CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR‑T细胞)。本发明专利技术还提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞的制造。本发明专利技术还提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞例如用于治疗与表达FLT3的恶性细胞相关的病状(例如，癌症)的用途。

Chimeric antigen receptor targeting FLT3

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】靶向FLT3的嵌合抗原受体相关申请的交叉参考本申请案要求2017年6月2日提交的美国临时申请第62/514,634号的优先权，其内容以全文引用的方式并入本文中。均公开FLT3特异性抗体的2017年6月2日提交的美国临时申请第62/514,574号；和2018年4月20日提交的美国临时申请第62/660,908号；以及2018年5月31日提交的标题为“对FLT3具有特异性的抗体和其用途”的PCT申请以全文引用的方式并入本文中。序列表的参考本申请经由EFS-Web电子申请并包括呈.txt格式的电子提交的序列表。所述.txt文档含有2018年5月24日创建的标题为“ALGN_010_01WO_SeqList_ST25.txt”且大小呈238KB的序列表。这一.txt文档中所含的序列表为本说明书的一部分并以全文引用的方式并入本文中。
本文提供Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性抗体；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)(FLT3CAR)；编码FLT3CAR的聚核苷酸；以及包含FLT3特异性CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR-T细胞)。本专利技术进一步涉及对免疫细胞进行工程化以表达FLT3特异性CAR的方法；以及使用FLT3特异性抗体和FLT3特异性CAR-T细胞来治疗与FLT3(例如，表达FLT3的恶性细胞)相关的病状的方法。
技术介绍
显示经基因修饰以识别恶性疾病相关抗原的免疫细胞的过继转移有希望作为治疗癌症的新型方法(参见例如，Brenner等人,《免疫学新见(CurrentOpinioninImmunology)》,22(2):251-257(2010)；Rosenberg等人,《自然综述：癌症(NatureReviewsCancer)》,8(4):299-308(2008))。T细胞可经基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，其为由抗原识别部分和T细胞活化域构成的一种融合蛋白(参见例如，Eshhar等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993)；和Sadelain等人,《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol)》,21(2):215-223(2009))。FLT3为急性骨髓性白血病(AML)靶抗原，在与健康细胞相比时，其过表达于AML患者胚细胞上，且表达于大多数患者细胞上(Carow等人,1996年2月2日《血液(Blood)》:87(3)；Birg等人1992年11月《血液》:80(10))。FLT3为AML患者中经常突变的基因，并且突变与不良预后相关(Abu-Duhier等人《英国血液学杂志(BrJHaematol.)》2000年10月；111(1):190-5；Yamamoto等人2001年4月15日；《血液》:97(8))。小分子FLT3抑制剂已在临床试验中显示出活性；然而，归因于获得性抗性，应答通常较为短暂。其它激酶抑制剂仅治疗一定百分比的表达FLT3的突变形式的患者，突显出对改进型疗法的迫切需要。因此，需要对癌症，并且确切地说，涉及FLT3的异常表达的恶性疾病的替代性治疗。本文提供解决这一需要的方法和组合物。
技术实现思路
本文提供特异性结合于Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)的抗体或其抗原结合片段；特异性结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)；以及表达所述CAR的工程化免疫细胞(例如FLT3特异性CAR-T细胞)。还提供所述抗体、CAR和免疫细胞的制造。进一步提供所述抗体、CAR和工程化免疫细胞例如用于治疗与表达FLT3的恶性细胞相关的病状(例如，癌症)的用途。在一个方面，本文提供特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含重链可变(VH)区，其具有表2中所列的部分VH序列中的任一个；和/或轻链可变(VL)区，其具有表2中所列的部分VL序列中的任一个。在另一态样中，本文提供一种特异性结合于FLT3的分离抗体，其中所述抗体包含(a)重链可变(VH)区，其包含表3中所列的互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3序列；和/或(b)轻链可变(VL)区，其包含表3中所列的CDR1、CDR2和CDR3序列。本文还提供结合于FLT3的嵌合抗原受体(CAR)。已证明，T细胞中FLT3特异性CAR的表达会在与FLT3接触后有效地活化T细胞。本文所提供的FLT3特异性CAR结合人类FLT3并在与表达FLT3的细胞接触后展现细胞毒活性。因此，在另一方面，本文提供一种FLT3特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含结合于FLT3的胞外域的单链可变片段(ScFv)。在一些实施例中，本文提供FLT3CAR，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含结合于FLT3靶向物的特定域的scFv，例如，结合于SEQIDNO:199(域1)、SEQIDNO:200(域2)、SEQIDNO:201(域3)、SEQIDNO:254(域2-3)、SEQIDNO:202(域4)或SEQIDNO:203(域5)、SEQIDNO:254(域2-3)或SEQIDNO:202(域4)。在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含包括ScFv的胞外域，其中所述ScFv结合于FLT3靶向物的域4(SEQIDNO:202)。在一些实施例中，FLT3特异性CAR包含包括ScFv的胞外域，其中所述ScFv结合于FLT3靶向物的域2(SEQIDNO:200)。FLT3特异性CAR的胞外域包含scFv，其中所述scFv包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，所述VH和VL区各自包含对FLT3具有特异性的三个互补决定区(CDR)。在一些实施例中，VH区包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQIDNO:37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中所示的氨基酸序列；(ii)VH互补决定区2(CDR2)，其具有SEQIDNO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中所示的氨基酸序列；和(iii)VH互补决定区3(CDR3)，其具有SEQIDNO:42、48、53、59、65、71、77、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外配体结合域包含单链可变片段(scFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述scFv结合于SEQ ID NO:202(FLT3的域4)或SEQ ID NO:200(FLT3的域2)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20170602 US 62/514634;20170602 US 62/514574;2018041.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外配体结合域包含单链可变片段(scFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述scFv结合于SEQIDNO:202(FLT3的域4)或SEQIDNO:200(FLT3的域2)。


2.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链可变片段(scFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)所述VH区包含(i)VH互补决定区1(CDR1)，其具有SEQIDNO:37、38、39、43、44、45、49、50、54、55、56、60、61、62、66、67、68、72、73、74、78、79、80、84、85、86、90、91、92、96、97、98、102、103、104、108、109、110、114、115、116、120、121、122、126、127、128、132、133、134、138、139、140、294、295、296、300、301、305、306、307、311、312、316、317或318中所示的氨基酸序列；(ii)VH互补决定区2(CDR2)，其具有SEQIDNO:40、41、46、47、51、52、57、58、63、64、69、70、75、76、81、82、87、88、93、94、99、100、105、106、111、112、117、118、123、124、129、130、135、136、141、142、297、298、302、303、308、309、313、314、319、320或322中所示的氨基酸序列；和(iii)VH互补决定区3(CDR3)，其具有SEQIDNO:42、48、53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、299、304、310、315或321中所示的氨基酸序列；和/或
(b)所述VL区包含(i)VL互补决定区1(CDR1)，其具有SEQIDNO:144、147、150、153、156、159、162、165、168、171、174、177、180、183、186、189、192、195、323、326、328、331、336、338、340、343、345、348或350中所示的氨基酸序列；(ii)VL互补决定区2(CDR2)，其具有SEQIDNO:145、148、151、154、157、160、163、166、169、172、175、178、181、184、187、190、193、196、324、329、332、334、341或346中所示的氨基酸序列；和(iii)VL互补决定区3(CDR3)，其具有SEQIDNO:146、149、152、155、158、161、164、167、170、173、176、179、182、185、188、191、194、197、325、327、330、333、335、337、339、342、344、347或349中所示的氨基酸序列。


3.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链可变片段(ScFv)，其包含具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列的重链可变(VH)区。


4.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链可变片段(ScFv)，其包含具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列的轻链可变(VL)区。


5.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链可变片段(ScFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中所述VH区包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列；并且所述VL区包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的序列。


6.一种Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外配体结合域、第一跨膜域和胞内信号传导域，其中所述胞外域包含单链可变片段(scFv)，其包含重链可变(VH)区和轻链可变(VL)区，其中
(a)所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:49、44或50中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:51或52中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:53中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:150中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:151中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:152中所示的氨基酸序列，或
(b)所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:90、91或92中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:93或94中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:95中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:171中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:172中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:173中所示的氨基酸序列。


7.根据权利要求2至5中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、265、267、269、271、273、275、277、279、281、283、285、287、289、291或293中所示的序列，或在未处于CDR中的残基中具有一个或若干个保守性氨基酸取代的其变异体；和/或所述VL区包含SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、264、266、268、270、272、274、276、278、280、282、284、286、288、290或292中所示的氨基酸序列，或在未处于CDR中的氨基酸中具有一个或若干个氨基酸取代的其变异体。


8.根据权利要求1至7中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:49、44或50中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:51或52中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:53中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:150中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:151中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:152中所示的氨基酸序列。


9.根据权利要求1至7中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:90、91或92中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:93或94中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:95中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:171中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:172中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:173中所示的氨基酸序列。


10.根据权利要求8所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含SEQIDNO:6中所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQIDNO:5中所示的氨基酸序列。


11.根据权利要求9所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含SEQIDNO:20中所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQIDNO:19中所示的氨基酸序列。


12.根据权利要求1至7中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:43、44或45中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:46或47中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:48中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:147中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:148中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:149中所示的氨基酸序列。


13.根据权利要求12所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含SEQIDNO:4中所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQIDNO:3中所示的氨基酸序列。


14.根据权利要求1至7中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含VHCDR1，其包含SEQIDNO:60、61或62中所示的氨基酸序列；VHCDR2，其包含SEQIDNO:63或64中所示的氨基酸序列；和VHCDR3，其包含SEQIDNO:65中所示的氨基酸序列；并且所述VL区包含VLCDR1，其包含SEQIDNO:156中所示的氨基酸序列；VLCDR2，其包含SEQIDNO:157中所示的氨基酸序列；和VLCDR3，其包含SEQIDNO:158中所示的氨基酸序列。


15.根据权利要求14所述的FLT3特异性CAR，其中所述VH区包含SEQIDNO:10中所示的氨基酸序列，并且所述VL区包含SEQIDNO:9中所示的氨基酸序列。


16.根据权利要求1至15中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述胞内信号传导域包含CD3ζ信号传导域。


17.根据权利要求1至15中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述胞内信号传导域包含4-1BB域。


18.根据权利要求1至17中任一项所述的FLT3特异性CAR，其包含第二胞内信号传导域。


19.根据权利要求18所述的FLT3特异性CAR，其中所述第二胞内信号传导域包含4-1BB域。


20.根据权利要求1至19中任一项所述的FLT3特异性CAR，其包含处于所述胞外配体结合域和所述第一跨膜域之间的茎域(stalkdomain)。


21.根据权利要求20所述的FLT3特异性CAR，其中所述茎域选自由以下组成的群组：CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链。


22.根据权利要求1至21中任一项所述的FLT3特异性CAR，其包含对单克隆抗体具有特异性的一个或多个表位。


23.根据权利要求22所述的FLT3特异性CAR，其中所述表位选自由以下组成的群组：CD52表位、CD20表位、CD3表位、CD41表位、CD25表位、CD30表位、EGFR表位、TNFα表位、VEGF表位、补体蛋白C5表位、CD11a表位、CD33表位、α-4整合素表位、IgEFc区表位、RSV蛋白F表位、IL-6受体表位、HER2受体表位、整合素α4β7表位、B细胞活化因子(BAFF)表位、IL-1β表位、RANKL表位、CTLA4表位、CD34表位、IL-12表位、IL-23表位和其组合。


24.根据权利要求22或23所述的FLT3特异性CAR，其中所述表位为由以下特异性识别的表位：阿仑单抗(alemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)、莫罗单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴利昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、西妥昔单抗(cetuximab)、英利昔单抗(infliximab)、利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、培塞利珠单抗(certolizumabpegol)、达利珠单抗(daclizumab)、艾库组单抗(eculizumab)、依法利珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、兰比珠单抗(ranibizumab)、托西利单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、QBEND-10或优特克单抗(ustekinumab)。


25.根据权利要求22至24中任一项所述的FLT3特异性CAR，其中所述表位为CD20表位。


26.根据权利要求25所述的FLT3特异性CAR，其中所述CD20表位包含SEQIDNO:229中所示的氨基酸序列。


27.根据权利要求1所述的FLT3特异性CAR，其中所述FLT3特异性CAR包含SEQIDNO:235、236、237或242中所示的氨基酸序列。


28.根据权利要求1所述的FLT3特异性CAR，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：BJ萨素，DE德特林，CA索默，YA杨，MM哈姆策，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US