一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型及其构建方法技术

本发明专利技术提供了一种稳定表达人源CaSR(钙敏感受体)基因的细胞模型，保藏在中国典型培养物保藏中心，命名为中国仓鼠卵巢细胞CHO‑CaSR，保藏编号为CCTCC NO:C201893，其构建方法是，将SNAP标签与CaSR基因通过连接序列cacgcgt相连，得到融合有SNAP标签的CaSR基因，将其与表达载体连接构建含有CaSR基因的重组质粒，将重组质粒转染哺乳动物细胞，经药物筛选培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株。该细胞模型既可用于筛选以CaSR为靶点的活性物质，又可通过SNAP‑tag与均相时间分辨荧光技术(HTRF)联合应用，准确快速研究CaSR与其它蛋白的相互作用及其寡聚化。该细胞模型能够高通量、低成本的筛选以CaSR为靶点的活性物质，筛选方法步骤简单可控，成本低，通量高，具有很好的稳定性和可靠性。

A cell model for stable expression of human CaSR gene and its construction method

【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型及其构建方法
本专利技术属于基因工程领域，涉及细胞模型的构建方法，具体涉及一种稳定表达人源CaSR(钙敏感受体)基因的细胞模型和其构建方法。
技术介绍
钙敏感受体(CaSR)，作为C族G蛋白偶联受体(GPCRs)超家族的一员，自1993年首次发现以来，已经在很多组织器官中进行了研究，发现其功能的改变与某些疾病的发生发展相关联。人类的CaSR基因位于3号染色体的长臂上(3q13.3-21)，主要由1078个氨基酸残基的多肽链组成，包括3个结构域：①由612个氨基酸组成的氨基胞外区(NH2-terminalextracellulardomain，ECD)，形成二聚体与Ca2+、Gd3+、Mg2+、精胺、庆大霉素等多种配体结合，大多数受体的激活和失活突变都发生在此区域；②由250个氨基酸组成的7次跨膜区(trans-menmbranedomains，TMD)；③由217个氨基酸组成的胞内羧基端尾部(COOH)，此处与G蛋白偶联，通过一系列信号转导通路，影响细胞的病理生理功能。Ca2+是CaSR的主要激动剂,许多多价阳离子(如Gd3+、Mg2+)、精胺、抗生素(新霉素)、L-氨基酸特别是芳香族氨基酸也是其激动剂。据报道，CaSR在不同的组织器官中，可能与不同的G蛋白偶联，Gq/11、Gi/o、Gs、G12/13等都有相关报道，被激活的CaSR主要与Gq相偶联，激活磷脂酶C(PLC)，进而影响其下游各种生理功能。CaSR在体内广泛分布，如甲状腺、甲状旁腺、肾脏、胃肠道、骨组织、皮肤等。CaSR主要在甲状旁腺和甲状腺中表达，分别调节甲状旁腺激素(PTH)及降钙素的合成与分泌来维持细胞外液中的Ca2+浓度。CaSR的突变引起的受体失活或者过度活化可引起相关疾病，如与受体失活相关的疾病包括家族性低尿钙性高钙血症，与CaSR活化突变相关的疾病包括常染色体显性低钙血症。CaSR也存在于包括食道、胃、小肠和结肠在内的胃肠道中，不仅可以促进食物消化、促进营养吸收、调节能量代谢，还有控制炎性反应，调节肠液平衡和免疫平衡的新兴作用。并且CaSR在结肠中具有肿瘤抑制作用，CaSR正变构调节剂可以增强其抑制肿瘤的效应，而负变构调节剂则抑制该效应。除此之外，CaSR在血管、平滑肌、内皮细胞、中枢神经系统、胰腺、骨髓及乳腺等中也有表达。CaSR具有维持和调节细胞内Ca2+和其他矿物离子体内平衡的作用，同时也参与细胞分泌、增殖、分化、趋化、凋亡、基因表达、维持膜电位、离子通道开关、衰老等过程的调控。目前针对CaSR的相关试剂已在一些疾病中进行了初步尝试，如CaSR激动剂盐酸西那卡塞(Cinacalcet)以别构调节的方式刺激CaSR的表达，现在已经应用于临床原发性甲状旁腺功能亢进(PHPT)的治疗。功能上的重要性将使得该受体成为重要的药物作用靶点，有着极高的潜在科研和市场价值。大量的动物实验及临床前研究表明CaSR在生理及病理过程中发挥重要作用。所以建立这样一种药物筛选模型，提供了一种更为高效、便捷的药物筛选方式，能快速的找到以CaSR为靶点的药物。基于细胞信号通路的高通量药物筛选(highthroughputscreening,HTS)是以细胞信号系统作为应答元件，通过高灵敏度的数据采集系统和技术手段检测作为药物靶点的受体及各种蛋白所介导的细胞内信号事件，从而观测化合物是否能作用于药物靶点，进而找到具有靶点选择性的先导化合物。而分子与细胞水平的药物筛选模型具有材料用量少、药物作用机制明确等特点，已经成为目前寻找和发现新药物的主要药物筛选方法(FONNUMF.Arapidradiochemicalmethodforthedeterminationofcholineacetyltransferase[J].JNeurochem,1975,24(2):407-409.)。将药物靶点导入工具细胞，并构建稳定的重组高表达目标药物靶点的细胞筛选模型，是实现高通量药物筛选的关键环节。药物筛选模型是用于证明某种物质具有药理活性(生物活性、治疗作用)的实验方法，是寻找和发现新药物的重要条件之一。目前，基于GPCR下游信号转导的高通量药物筛选方法学相对比较成熟，多家公司可提供高通量检测仪器及方案。药物筛选模型的发现和构建则成为制约和推动该领域发展的重要因素，尤其是基于受体分子机制的模型构建更是成为发现新型先导化合物的核心技术和难点。现有技术中还没有能够高通量筛选以CaSR为靶点活性物质的细胞模型。O6-鸟嘌呤烷基-DNA烷基转移酶(O6-alkylguanine-DNAalkyltransferase,AGT)是一种核蛋白，它通过把烷基化DNA链上鸟嘌呤O6-位的烷基转移至自身活性中心的半胱氨酸上，来行使DNA修复功能。2003年，Johnsson等利用AGT的这一性质开发了一种新型的蛋白标记技术——SNAP-tag。通过对AGT进行改造得到一种与苯甲基鸟嘌呤(benzylguanine，BG)衍生物高特异性共价结合的蛋白，分子量为22KDa，后命名为SNAP-tag蛋白。由于BG可带各种不同的其它化学基团，如生物素、荧光素(fluorescein)、罗丹明(rhodamine)等，从而实现一种标签蛋白可以被多种配体标记，是一种具有革命性意义的自我标记蛋白标签。与其它蛋白靶向标记方法相比，SNAP-tag有其独特的优点：1)与特定底物的反应速度快，且特异性高、稳定性好；2)用于标记的荧光染料多样化，通过调控染料性能，可满足各种荧光成像研究的需求，灵活性更高；3)可开发多种功能性配体。在过去的十几年中，SNAP-tag特异性蛋白标记技术已成为一种用于与蛋白质相关的生物医学和生物工程研究的多功能检测标记工具。通过SNAP-tag对蛋白质的特异性标记，对于在体外、细胞内及活体水平研究蛋白质的结构、性质及功能具有较好的适用性。例如，在活体水平和细胞水平融合蛋白成像中的应用；在细胞内进行蛋白质与蛋白质相互作用研究；在蛋白质固定化中的应用；在疾病诊断与微生物致病机理研究中的应用。构建SNAP-tag与CaSR的融合蛋白，为进一步地对CaSR靶蛋白结构动态变化、发生运输的实时动态过程跟踪检测，便于研究CaSR参与的多种生理和生化过程，以及CaSR所涉及的疾病诊断治疗、新药开发等，提供更加强有力的技术手段。
技术实现思路
本专利技术的任务是建立一种稳定表达人源CaSR基因的细胞模型，以克服上述现有技术中的不足。实现本专利技术的技术方案是：本专利技术提供的这种细胞模型，是携带并能表达CaSR基因的哺乳动物细胞，即该细胞模型是克隆了表达编码人源CaSR基因序列的体外培养的哺乳动物细胞。本专利技术提供的这种表达人源CaSR基因的细胞模型，它是中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR，已于2018年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201893，保藏地址为中国武汉，武汉大学。所述的CaSR基因(GeneID:846)的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达人源CaSR基因的细胞模型，其特征在于，它是中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR，已于2018年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201893，保藏地址为中国武汉，武汉大学。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达人源CaSR基因的细胞模型，其特征在于，它是中国仓鼠卵巢细胞CHO-CaSR，已于2018年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201893，保藏地址为中国武汉，武汉大学。


2.一种细胞模型，其特征在于，该细胞模型是携带并能表达CaSR基因的哺乳动物细胞，所述CaSR基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。


3.根据权利要求2所述的细胞模型，其特征在于，所述哺乳动物细胞是CHO细胞或HEK293细胞。


4.权利要求1～3中的任意一项所述的细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将SNAP标签与CaSR基因通过SEQIDNO:4所示的连接序列相连，得到融合有SNAP标签的CaSR基因；
(2)将融合有SNAP标签的CaSR基因与表达载体连接，构建含有CaSR基因的重组质粒pcDNA5/FRTFlag-Snap-CaSR(human)；
(3)将上述重组质粒转染哺乳动物细胞，经过药物筛选，培养成能稳定表达CaSR基因的细胞株，该细胞株即为所述的细胞模...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘剑峰，殷学梁，汤恒敏，王素云，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42