地锦草提取物及没食子酸的新用途制造技术

本发明专利技术公开了地锦草提取物及没食子酸作为制备诱导细胞自噬和/或凋亡药物的新用途。没食子酸为地锦草的活性成分之一，其可有效地诱导细胞发生自噬及凋亡，其在一定浓度范围内，具有一定的浓度和时间依赖效应，最终并引起细胞凋亡，可为临床上更合理的将地锦草用于相关疾病的治疗提供理论依据。

New use of Dijincao extract and gallic acid.

The invention discloses a new application of Dijincao extract and gallic acid in preparation of autophagy and / or apoptosis induced by drugs. As one of the active constituents of Euphorbia humifusa gallic acid, which can efficiently induce cell autophagy and apoptosis, which in a certain range of concentration, with a certain concentration and time dependent manner, and ultimately induce apoptosis, for clinical rational for the treatment of diseases related to Dijincao will provide a theoretical basis for the.

【技术实现步骤摘要】
地锦草提取物及没食子酸的新用途
本专利技术属于药物领域，具体涉及地锦草提取物及没食子酸的新用途，特别是作为制备诱导细胞自噬和凋亡药物的用途。
技术介绍
地锦草为大戟科植物地锦（EuphorbiahumifusaWilld.）的干燥全草，维医习用名为夏塔热（Xiahatereqini）、雅丽蔓（Yalmankulake），地锦草是一年生匍匐草本，喜生长于田野，路边和荒地，是一种维吾尔医常用药材。具有清热解毒，凉血止血的功效，常用于治疗用于痢疾，泄泻，咯血，尿血，便血，崩漏，疮疖痈肿等疾病。现代研究证明其具有抗氧化、抗炎、抗病毒、降血糖、降血脂、免疫调节等生物活性。没食子酸（Gallicacid）亦称五倍子酸或棓酸，是一种有机酸，化学式C6H2(OH)3COOH。没食子酸易溶于水、醇和醚；具有酚及羧酸的性质。没食子酸具有抗氧化，抗菌,抗病毒，抗肿瘤药理作用，广泛运用于农业、视频我和其他领域。细胞自噬(autophagy)是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。该过程是真核生物通过双层膜结构的自噬小泡包裹细胞内受损蛋白质、细胞器或外源成分，经溶酶体（动物）或液泡（植物和酵母）进行降解并得以循环利用的一种具有进化保守性的生物学过程。在生理状况下的自噬，对于维持细胞稳态有积极作用；肿瘤形成以后，细胞自噬反为癌细胞提供更多的营养，起到促进肿瘤发展的功能。自噬主要有三种方式，即分子伴侣介导的自噬、微自噬和巨自噬，均通过两个泛素化途径实现。细胞自噬与细胞凋亡、细胞衰老一样，是十分重要的生物学现象，参与生物的发育、生长等多种过程。细胞自噬可以维持细胞的内平衡，协助维持细胞回归正常状态的重要机制。利用中药中的活性成分诱导细胞自噬，可以做为相关临床治疗的备选方案之一。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供地锦草提取物及没食子酸的新用途。地锦草提取物作为制备诱导细胞自噬和/或凋亡药物的用途。所述地锦草提取物为地锦草全草的水提取物或醇提取物。没食子酸作为制备诱导细胞自噬和/或凋亡药物的用途。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1：没食子酸的高效液相色谱图，1为没食子酸标准品，2为地锦草全草提取物。图2：地锦草全草水提取物诱导细胞自噬的激光共聚焦图。图3：地锦草全草醇提取物诱导细胞自噬的激光共聚焦图。图4：不同浓度没食子酸诱导细胞自噬的激光共聚焦图。图5：50μg/ml没食子酸诱导细胞凋亡的激光共聚焦图。图6：没食子酸处理后自噬蛋白GFP-LC3表达的WesternBlotting图。图7：不同浓度没食子酸诱导细胞自噬的电镜图。图8：50μg/ml没食子酸诱导细胞凋亡的电镜图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。地锦草全草提取物制备方法：1：取地锦草全草粉末10.0g，加蒸馏水200mL，室温浸泡24h，过滤，倒出。滤渣同法再制备一次，合并滤液，过滤，水浴浓缩至10mL，离心，取上清液，得到地锦草全草水提取物，存于4℃。2：取地锦草全草粉末10.0g，加95%乙醇200mL，室温浸泡24h，过滤，倒出。滤渣同法再制备一次，合并滤液，过滤，水浴浓缩至10mL，离心，取上清液，得地锦草全草醇提取物，存于4℃。地锦草全草提取物含有的没食子酸（GA）是通过高效液相色谱法（HPLC）进行分析；其定量分析条件为：采用AgilentZORBAXSB-C18柱（4.6mm×250mm，5µm）分离；以甲醇-0.4%磷酸水溶液为流动相，流速0.8mL/min，进样量8µL，检测波长为270nm进行检测，梯度洗脱程序：流动相A为0.4％磷酸水溶液，流动相B为甲醇，随时间调整流动相B中的体积百分数：0～2min，10%～28%B；2～7min，28%～40%B；7～10min，40%～50%B；10～15min，50%～60%B,15～18min，60%～63%B,18～20min，63%～65%B,20～25min，65%B。LC3蛋白标记法检测GA诱导NRK细胞自噬和凋亡作用LC3是细胞自噬信号通路中的一个标志性蛋白，具有LC3I和LC3II两种亚型。在无自噬作用发生的时候，该蛋白在胞质中以水溶性的LC3I亚型存在，在细胞发生自噬作用时，该蛋白会转化为水不溶性的LC3II亚型。通过检测细胞中LC3I含量的变化，可以判定细胞发生自噬作用的强弱。在构建LC3过表达载体时，载体中自带的GFP基因可表达绿色荧光蛋白，当此载体进入细胞后，在载体携带的LC3蛋白表达的同时，绿色荧光蛋白也会在488nm激发光下可见绿色荧光。由于LC3I型蛋白为水溶性蛋白，在细胞中会以弥散状态存在；而LC3II型蛋白在水中以聚集态存在。因此，通过激光共聚焦观察细胞中绿色荧光的分布情况，即可了解LC3I型和LC3II蛋白在细胞中的存在情况，进一步可判定细胞是否发生自噬及发生程度。一、NRK细胞株体外培养本试验所用细胞为大鼠肾小球上皮细胞（NRK细胞），使用添加10%胎牛血清（fetalbovineserum，FBS，Gibco）的1640培养液，在37℃，5%CO2培养箱中进行细胞培养，待细胞生长至占培养皿底部80-90%时，使用0.25%胰酶-EDTA消化并传代。二、试验方法GA标准品溶解于二甲亚砜（DMSO）中，配制成50mg/ml浓缩液，-20℃保存，使用时分别将GA稀释为1、5、10、25、50μg/ml；构建LC3过表达载体，并通过脂质体法将其转入NRK细胞中，使细胞中的LC3I型蛋白大量表达。1.将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以5×105/孔密度种植于激光共聚焦专用皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中12-18h后，移除原培养液，加入新鲜配置的不同浓度的GA培养液培养4h和24h，其浓度分别为：GA浓度为1、5、10、25、50μg/ml；在培养4h和24h后，在激光共聚焦下观察绿色荧光的分布情况。2.将细胞消化，离心并重悬浮于相应培养液中，以5×105/孔密度种植于激光共聚焦专用皿中，置于37℃，5%CO2培养箱中12-18h后，移除原培养液，加入新鲜配置的不同浓度的GA培养液培养4h，其浓度选择分别为：GA浓度为10、25、50μg/ml。在培养4h后终止培养，细胞终止培养后立即收集细胞总蛋白，然后用WesternBlotting法检测LC3I和LC3II蛋白的表达量的变化。三、实验结果1.激光共聚焦结果显示，随着GA浓度的升高，浓度在1-25μg/ml范围内，细胞中聚集的绿色荧光颗粒有明显的增多趋势，超过25μg/ml有下降趋势，直至在50μg/ml细胞出现凋亡状态，不同浓度没食子酸标准品诱导细胞自噬的激光共聚焦图见图4-5。地锦草全草水提取物诱导细胞自噬的激光共聚焦图见图2，地锦草本文档来自技高网...

【技术保护点】
地锦草提取物作为制备诱导细胞自噬和/或凋亡药物的用途。

【技术特征摘要】
1.地锦草提取物作为制备诱导细胞自噬和/或凋亡药物的用途。2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈木拉提·吾甫尔，文娥，米娜，田树革，
申请(专利权)人：新疆医科大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65